ОБЗОРЫ
Молекулярно-генетические механизмы, сигнальные пути, условия, факторы и маркеры остеогенной дифференцировки мезенхимных стволовых клеток (МСК) активно изучаются, несмотря на то, что считаются одними из наиболее исследованных направлений в области клеточных технологий. Во многом это обусловлено накопившимися противоречиями в, казалось бы, классических знаниях, а также постоянным обновлением результатов в анализируемой области. В связи с этим мы сосредоточили внимание на основных классических представлениях и некоторых новых факторах и механизмах, оказывающих заметное регуляторное влияние на дифференцировочный потенциал постнатальных МСК. В обзоре рассматривается значение источника получения МСК для реализации их дифференцировочного потенциала, роль клеточного микроокружения. Освещаются вопросы классификации, терминологии и функциональной активности МСК из различных источников. Описаны молекулярно-генетические факторы и сигнальные пути дифференцировки МСК; рассмотрены как классические участники остеогенеза с описанием их новых функциональных свойств, так и новые молекулы, способные участвовать в процессах костеобразования. Отмечено, что данные об основных генах, задействованных в процессе остеогенеза, крайне противоречивы. Проанализирован паракринный потенциал МСК в механизмах регенерации тканей; отмечено важнейшее значение воспаления в остеогенезе, в частности присутствие в очаге повреждения воспалительных цитокинов и хемокинов, продуцируемых не только клетками микроокружения, но и клетками крови, в том числе мононуклеарными лейкоцитами, мигрирующими в очаг повреждения. Важная роль в настоящем обзоре отведена рассмотрению биомеханических сигналов и особенностей влияния конформационных изменений клеточного цитоскелета (формы клетки) на дифференцировку МСК, так как морфологические особенности клеток и структура цитоскелета модулируется взаимодействием клеточной поверхности с факторами окружающей среды, включая гидростатическое давление, поток жидкости, нагрузка на сжатие/растяжение. Представлены данные о том, что эластичность экстрацеллюлярного матрикса является одним из определяющих факторов клеточной дифференцировки. Сделано заклю чение о необходимости перехода от точечного изучения эффектов отдельных генов к множественным измерениям генно-регуляторного профиля и биомолекул, ответственных за реализацию многочисленных, полностью не изученных остеогенных факторов эндогенного и экзогенного происхождения. Одним из краеугольных направлений в будущих (эпи)генетических исследованиях будет решение вопроса о том, реализуются ли остеомодулирующие эффекты через специфические сигнальные пути и/или имеется перекрестный сигналинг с известными генами остеогенной дифференцировки МСК.
Естественные киллеры (NK-клетки, англ. natural killers) – лимфоциты, относящиеся к клеткам врожденного иммунитета, они играют ключевую роль в поддержании иммунологического надзора. С момента обнаружения NK-клеток в 1973 году механизмы их функционирования были детально изучены, и сейчас не остается сомнения в том, что они играют особую роль в процессах распознавания и уничтожения трансформированных и малигнизированных клеток. Понимание роли NK-клеток в противоопухолевом иммунитете с одной стороны ведет к появлению новых иммуннотерапевтических стратегий, а с другой – позволяет переосмыслить существующие схемы лечения онкологических заболеваний в соответствии с принципом primum non nocere. Оптимизация протоколов терапии опухолей, выполненная с целью уберечь иммунные клетки от гибели и функционального ослабления, – важная проблема, которая не может быть успешно решена без регулярного обобщения результатов разрозненных исследований и критического анализа накопленных данных.
Задачей настоящего обзора является анализ изменений фенотипа и функциональной активности NK-клеток у больных миелодиспластическим синдромом (МДС) и острым миелоидным лейкозом (ОМЛ). Для лечения этих заболеваний в настоящее время применяются препараты из группы гипометилирующих агентов, механизм действия которых, в отличие от классических цитостатических средств, основан на модуляции экспрессии генов опухолевых клеток. Поскольку эти препараты действуют неспецифично, воздействию подвергаются все клетки организма, в том числе и NK-клетки. Такое взаимодействие приводит к гипометилированию NK-клеточной ДНК и изменению экспрессии функциональных рецепторов, которые, в свою очередь, обеспечивают развитие противоопухолевого ответа NK-клеток.
Сам по себе факт изменения генной экспрессии тех или иных клеток не позволяет в полной мере судить о воздействии препарата на состояние иммунной системы, важен характер этого изменения и его роль в контексте патогенеза исследуемого заболевания. В конечном счете, простое описание явления увеличения или уменьшения экспрессии отдельно взятого рецептора не является наглядно-показательным, поскольку может приводить к неоднозначным последствиям. По этой причине в настоящем обзоре, помимо описания существующих данных об изменении экспрессии рецепторов NK-клеток под воздействием гипометилирующих препаратов, особое внимание уделяется критическому анализу функциональных характеристик NK-клеток, среди которых наиболее важной для течения описываемых заболеваний является цитотоксическая активность, направленная на малигнизированные бластные клетки.
Хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ) – прогрессирующее заболевание, характеризующееся необратимой или частично обратимой обструкцией бронхиального дерева. В настоящее время существует множество научно подтвержденных звеньев этиопатогенеза ХОБЛ, среди которых основополагающая роль отводится значению гиперергической воспалительной реакции в ответ на вдыхание различных вредных веществ (табачный дым, промышленные поллютанты и др.). В легких больных ХОБЛ увеличивается количество макрофагов, нейтрофилов, лимфоцитов, причем эти клетки выделяют достаточно широкий спектр медиаторов воспаления. Одной из ключевых особенностей этиопатогенеза ХОБЛ является бактериальная колонизация дыхательных путей, приводящая к персистирующей или хронической стимуляции иммунных клеток через Toll-подобные рецепторы (TLR), которые воспринимают патоген-ассоциированные молекулярные паттерны (PAMPs).
В данной статье приведен литературный обзор современных представлений о роли экспрессии и полиморфизма Toll-подобных рецепторов, в частности TLR4, в патогенезе ХОБЛ. TLR4 является членом семейства Toll-подобных рецепторов, которые играют фундаментальную роль в идентификации патогенов и активации врожденного иммунитета. Распознавая патоген-ассоциированные молекулярные паттерны (PAMPs), которые экспрессируются на инфекционных агентах, TLR опосредуют выработку цитокинов, необходимых для развития эффективного иммунитета. Различные TLR демонстрируют различные паттерны экспрессии. Этот рецептор наиболее обильно экспрессируется в плаценте и в миеломоноцитарной субпопуляции лейкоцитов. В исследовании Di Stefano A. и соавт. (2017) иммуногистохимически были определены уровни экспрессии TLR2, TLR4, TLR9, NOD1, NOD2, CD14, Toll-интерлейкин-1-рецепторного домена, содержащего адапторный белок (TIRAP) и интерлейкин-1-рецептор-ассоциированных фосфокиназ (IRAK1 и IRAK4) в слизистой оболочке бронхов пациентов со стабильным течением ХОБЛ различной степени тяжести. Стало известно, что экспрессия TLR4 бронхиального эпителия положительно коррелировала со степенью обструкции и содержанием CD4+ и CD8+ клеток. Стимуляция TLR4 усиливает выработку цитокинов, что может быть релевантным механизмом, с помощью которого бактерии вызывают чрезмерное воспаление у пациентов с ХОБЛ. Вопрос степени вовлеченности TLR4 в патогенез ХОБЛ требует дальнейшего более подробного изучения с целью определения основных механизмов формирования воспали тельного ответа в дыхательных путях. Данная обзорная статья является частью грантового проекта по изучению провоспалительного ответа на эндотоксин грамотрицательной флоры в патогенезе ХОБЛ (Номер государственного учета НИОКТР – АААА-А19-119122390040-2).
Атопический дерматит – одно из наиболее распространенных хронических воспалительных заболеваний кожи, обусловлено как терминальными дефектами дифференцировки кератиноцитов, так и выраженными иммунными реакциями 2-го типа. Атопический дерматит – достаточно гетерогенное заболевание, в зависимости от возрастного подтипа, вызванное активацией Th22-, Th17/ IL-23- и Th1-пути цитокинов. Клинические исследования с применением классической и таргетной терапии помогли выяснить вклад различных иммунных осей в фенотип заболевания.
Представлена современная теория опосредованности активации Th2-реакций за счет врожденных лимфоидных клеток 2-й группы. Описаны корреляции иммунного ответа при острых (IL-4, IL-5, IL-13, IL-31, CCL18, IL-22, белки S100A) и хронических (IFNγ, CXCL9 и CXCL10) проявлениях атопического дерматита. Обсуждается теория взаимосвязи клинических проявлений и сверхэкспрессии ряда цитокинов (IL-4, IL-13). Показана корреляция фенотипа периферической крови при атопическом дерматите раннего детского возраста и у взрослых пациентов с выработкой отдельных сывороточных биомаркеров. В дополнение к избыточной выработке Th17, раннее начало атопического дерматита у детей коррелировало с повышенными уровнями антимикробных пепдидов, что может служить сигнальным маркером, запускающим заболевание. В статье даны сведения о взаимосвязи атопического дерматита с другими системными неаллергическими процессами и заболеваниями (псориаз, атеросклероз, сердечно-сосудистые заболевания, ожирение). Несмотря на разную полярность Т-клеток при атопическом дерматите и псориазе и разные группы вырабатываемых цитокинов при данных заболеваниях (псориаз в значительной степени обусловлен Th17 и связанной с ними активацией IL-17, атопический дерматит – следствие доминирования Th2, и связанной с ними избыточной продукцией IL-4 и IL-13), оба заболевания демонстрируют активацию Th1 и Th22 с повышением продукции интерферона-γ и IL-22 соответственно. В статье также описана интересная гипотеза влияния белка TWEAK на течение атопического дерматита и псориаза. Кератиноциты и фибробласты кожи в ответ на повышенную активность TWEAK производят ряд хемоатрактивных и провоспалительных факторов, обычно встречающихся при атопическом дерматите и псориазе, в частности IL-13 и IL-17. Изолированно TWEAK не является этиологическим фактором атопического дерматита или псориаза, но он вызывает продукцию хемокинов, которые способствуют хемотаксису патогенных воспалительных клеток в кожу. При дальнейшем изучении данного патогенетического фактора станет возможным синтезировать новый таргетный препарат для лечения атопического дерматита и псориаза.
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
IgA является важным компонентом мукозальной системы организма, поскольку ограничивает поступление патогенов в кровоток. С нарушениями в синтезе IgA могут быть связаны такие воспалительные заболевания кишечника, как болезнь Крона и неспецифический язвенный колит. В кишечнике источником IgA являются как B1-клетки, так и В2-клетки. Особое внимание уделяется B1-клеткам, благодаря их способности отвечать преимущественно на Т-независимые антигены второго типа и вырабатывать естественные антитела. B1-клетками образуется около 50% всех IgA в кишечнике, в числе которых есть и специфические антитела к компонентам микроорганизмов, содержащихся на слизистых в желудочно-кишечном тракте. Механизм образования IgA T-независимым способом исследован не достаточно полно. Имеется предположение, что помощь в переключении на синтез IgA могут оказывать γδТ-клетки. В пользу этого предположения может свидетельствовать совместная локализация с В1-лимфоцитами в слизистой оболочке кишечника и участие наравне с В1-клетками в формировании первой линии защиты от патогенов. Кроме того, обе эти субпопуляции лимфоцитов появляются в онтогенезе первыми, раньше «классических» В2- и αβТ-клеток. Исходя из этого, было сделано предположение, что γδT-лимфоциты могут быть вовлечены в процессы индукции и/или регуляции образования IgM и IgA B1-клетками при ответе на ТН2-антигены.
В настоящей работе было проведено исследование воздействия γδТ-клеток на образование В1- лимфоцитами IgA- и IgM-продуцентов in vitro в ответ на α(1,3)-декстран. Также было проведено исследование динамики экспрессии мРНК тяжелых цепей IgM и IgA B1-клетками в культурах в разные сроки после помещения в систему in vitro.
В ходе исследования было получено, что при совместном культивировании B1-клеток с 20% γδТлимфоцитов не происходит увеличения числа специфичных к декстрану IgM-продуцентов. Экспрессия мРНК тяжелой цепи IgM в совместной культуре в ответ на декстран также была сниженной, по сравнению с ответом чистой культуры B1-клеток. Вопреки ранее сделанному предположению, присутствие γδТ-лимфоцитов в культуре не увеличивало образование IgA-продуцентов. Полученные данные свидетельствуют о проявлении регуляторных свойств γδТ-лимфоцитов при ответе B1-клеток на Т-независимые антигены.
Данная статья представляет собой второе сообщение из серии статей, посвященных получению отечественного препарата макрофаг-активирующего фактора (GcMAF-RF) и оценке его биологических свойств. Целью данной работы являлось изучение воздействия препарата GcMAF-RF на М0 → М1 поляризацию макрофагов (Мф) и активацию профессиональных свойств антиген-презентирующих дендритных клеток (ДК), генерированных ex vivo, а также на ex vivo продукцию провоспалительных (TNFα, IL-1β, IL-6, IFNγ, IL-17, IL-18) и противовоспалительных (TGF-β, IL-4, IL-10) цитокинов, факторов роста (IL-2, GM-CSF, G-CSF, VEGF) и хемокинов (MCP, IL-8) клетками цельной крови здоровых доноров. Мф и ДК генерировали из моноцитов (3-5 × 106 /мл) прилипающей фракции мононуклеарных клеток (МНК) периферической крови здоровых доноров; при этом для получения Мф использовали гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (rhGM-CSF), а при получении ДК – GM-CSF и интерферон-α. В качестве М1-поляризующих сигналов использовали липополисахарид (LPS Е. coli 0114:B4) (контроль) либо препарат GcMAF-RF (опыт), которые добавляли за 48 ч до окончания культивирования. Стимулирующее влияние полученных Мф и ДК на пролиферацию клеток оценивали в аллогенной смешанной культуре лейкоцитов (алло-СКЛ) радиометрически по включению 3H-тимидина. Индекс влияния (ИВ) Мф или ДК на алло-СКЛ рассчитывали как отношение пролиферативного ответа МНК в присутствии Мф или ДК к уровню спонтанной пролиферации МНК. Для определения продукции цитокинов клетками цельной крови человека ex vivo использовали образцы периферической крови 3 доноров с двумя повторностями препарата GcMAF-RF, итого 6 вариантов. Все варианты исследования проведены на активированных митогеном и неактивированных клетках крови. Содержание цитокинов определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа. Для количественной оценки воздействия GcMAF-RF использован индекс влияния (ИВ) как отношение продукции цитокина в присутствии GcMAF-RF к уровню спонтанной продукции. Показано, что препарат GcMAF-RF эффективно, как и «стандартный» активатор Мф и ДК липополисахарид (LPS), индуцирует поляризацию дифференцированных М0-макрофагов в М1-клетки и конечное созревание ДК, что проявляется значимым усилением их аллостимуляторной активности в смешанной культуре лейкоцитов (алло-СКЛ). Кроме того, препарат GcMAF-RF стимулирует продукцию клетками крови (гранулоцитами, лимфоцитами, моноцитами) широкий спектр цитокинов и хемокинов (TNFα, IL-1β, IL-6, IL-18, IL-4, IL-10, GM-CSF, G-CSF, VEGF, IL-8), что свидетельствует о прямом участии активатора макрофагов GcMAF-RF в различных иммунных процессах. Таким образом, отечественный препарат GcMAF-RF индуцирует поляризацию макрофагов M0 → M1, конечное созревание ДК и аллостимулирующую активность Мф и ДК, а также способен эффективно стимулировать циркулирующие клетки крови к синтезу цитокинов/хемокинов с провоспалительной и иммунорегуляторной активностью.
Отделяющиеся от плазматической мембраны клетки экстраклеточные везикулы принимают активное участие в межклеточной коммуникации, транспортируя широкий спектр молекул, среди которых важное функциональное значение придается белкам, липидам, нуклеиновым кислотам и сахарам. Одним из важных этапов в понимании дистантной коммуникации клеток и механизмов ее регуляции является изучение протеома различных экстраклеточных везикул, в том числе микровезикул и экзосом. Синтезируемые моноцитами провоспалительные цитокины и отдельные компоненты системы комплемента играют ключевую роль в осуществлении их специфических функций. Целью данного исследования явилось изучение протеомного состава моноцитоподобных клеток линии THP-1 и продуцируемых ими микровезикул. В результате MALDI-масс-спектрометрического анализа электрофоретических белковых фракций лизата клеток и микровезикул идентифицировано 107 белков, выполняющих различные функции. Среди 19 функциональных групп наибольшие по численности группы образуют белки-регуляторы транскрипции и белки c неизвестными функциями, домены. Наименьшие по численности функциональные группы представлены белками-регуляторами клеточной дифференцировки и морфогенеза, белками иммунного ответа и воспаления, рецепторами и их регуляторами, транспортными белками и белками-регуляторами транспорта, белками-регуляторами клеточной адгезии и процессинга белков, белками убиквитин-протеасомной системы деградации белков, белками внутриклеточной сигнализации, белками-регуляторами аутофагоцитоза и экзоцитоза, белками структуры хроматина, белками-регуляторами гемостаза, гормонами. Промежуточное положение занимают цитокины и факторы роста, ферменты, белки цитоскелета, структурные и моторные белки, белки-регуляторы трансляции, транскрипции и процессинга РНК. С помощью последующего кластерного анализа (DAVID Functional Annotation Clustering) идентифицированы наиболее широко представленные группы белков, распределенных по молекулярной функции, биологическому процессу и по положению в клетке. Отдельно в микровезикулах идентифицированы среди прочих белковых молекул белки иммунного ответа и воспаления, цитокины и факторы роста, белки внутриклеточной сигнализации, белки-регуляторы клеточной дифференцировки и морфогенеза, белки-регуляторы клеточной адгезии. Полученные данные о частичном протеоме моноцитоподобных клеток линии THP-1 и продуцируемых ими микровезикул расширяют имеющиеся представления о дистантной коммуникации клеток и указывают на новые механизмы взаимодействия моноцитов/макрофагов и их микроокружения.
Определение воспалительных маркеров в крови условно здоровых людей представляет интерес в связи с возможностью выявления заболеваний на ранних (доклинических) стадиях, а также скрытых форм патологических процессов. Уровень воспаления может служить дополнительным критерием при формировании контрольных групп в клинических и биологических исследованиях.
Цель исследования – определить некоторые воспалительные и аутоиммунные маркеры в группе условно здоровых людей и провести кластерный анализ полученных данных.
Обследовано 100 условно здоровых людей (без клинических признаков инфекций, соматических, неврологических или психических заболеваний) в возрасте от 19 до 88 лет. В сыворотке крови определяли уровни IL-10, TNFα, IL-6 и аутоантител к S100b и ОБМ с помощью ELISA, спектрофотометрически определяли ферментативную активность лейкоцитарной эластазы (ЛЭ) и функциональную активность α1-протеиназного ингибитора (α1-ПИ). Протеазно-ингибиторный индекс (ПИИ) рассчитывали как отношение ЛЭ к α1-ПИ. В качестве основного подхода для статистического обработки данных использовали кластерный анализ, а также метод Шапиро–Уилка, Краскела–Уоллиса и ANOVA.
Все обследуемые по иммунологическим показателям были разделены на три кластера. Выделенные кластеры статистически значимо отличались друг от друга по активности ЛЭ, протеазно-ингибиторный индексу (ПИИ) и уровню IL-10 и TNFα.
Показатели одного из этих кластеров (43% обследованных) в наибольшей степени приближены к средним показателям, определенным для общей выборки, что дает основание рассматривать иммунные показатели этого кластера как нормативные, соответствующие «фоновому» состоянию иммунитета у здоровых людей.
Сочетание иммунологических показателей двух других кластеров (30 и 27% обследуемых, соответственно) отражает различные варианты воспалительных реакций. Эти кластеры характеризуются разнонаправленными изменениями активности ЛЭ и протеазно-ингибиторного индекса, относительно нормативных значений, что может свидетельствовать о различных вариантах латентной воспалительной реактивности, реализующейся у пациентов, составивших эти кластеры.
Полученные кластеры не различались по возрасту исследуемых (p = 0,3476), что позволяет исключить значимое влияние возраста на определяемые иммунные показатели, и по гендерным признакам (p = 0,7233). Выделенные кластеры статистически не различались по функциональной активности α1-ПИ и по уровню аутоантител к нейроспецифическому белку S100b и ОБМ.
Таким образом, группа условно здоровых людей неоднородна по маркерам воспаления. Воспалительные реакции различной степени выраженности выявлялись примерно в половине случаев. Вероятно, это может указывать на наличие скрытого патологического процесса и требует подробного клинического обследования.
Одной из основных проблем общественного здравоохранения во всем мире является метаболический синдром (МС), приводящий к значительным трудопотерям, увеличению расходов на лечение и реабилитацию больных. Цель исследования – выявление информативных сывороточных интерлейкинов на основе определения показателей отношения шансов у больных пожилого возраста с МС и АГ. Обследовано в клинических условиях 86 больных МС и АГ в возрасте 60-75 лет (основная группа). Критериями включения являлись: возраст 60-75 лет, наличие МС, первичная АГ – II-III степени, отсутствие острого инфаркта миокарда, злокачественных новообразований, нарушений мозгового кровообращения, почечной недостаточности за последние 6 месяцев. Диагностика МС и АГ проводились в соответствии с Рекомендациями экспертов Всероссийского научного общества кардиологов по диагностике и лечению МС. Впервые проведенное нами исследование большого спектра сывороточных интерлейкинов у пациентов пожилого возраста с МС и АГ позволило установить изменения противоположной направленности в содержании провоспалительных и противовоспалительных цитокинов. Сочетание АГ с МС у пожилых сопровождается существенным повышением большинства провоспалительных интерлейкинов и, напротив, достоверным снижением продукции противовоспалительных цитокинов. Это однозначно указывает, что в инициировании МС с АГ в пожилом возрасте важное значение имеют иммунологические регуляторные системы. Провоспалительные и противовоспалительные сывороточные интерлейкины активно вовлечены в развитие МС с АГ в пожилом возрасте и сопровождаются выраженным дисбалансом. Указанные иммунологические реакции могут являться первопричинной МС в сочетании с АГ. Высокий риск развития данной патологии связан как с изменением продукции провоспалительных (IL-8, IL-1β), так и провоспалительных (IL-4, IL-10) интерлейкинов сыворотки крови с преобладанием патологического вклада первых. Перечисленные интерлейкины следует считать ведущими диагностическими маркерами МС с АГ у пожилых. Использование сывороточных интерлейкинов и дискриминантного метода позволяет с высокой безошибочной вероятностью классифицировать пожилых больных с МС и АГ от аналогичного возраста пациентов без этой патологии.
COVID-19 – инфекция, вызванная новым коронавирусом SARS-CoV-2, связана с рядом патофизиологических механизмов, которые мобилизуют широкий спектр биомолекул, в основном цитокинов. Целью настоящего исследования стала оценка уровней широкого спектра цитокинов в плазме крови больных COVID-19 в острой фазе заболевания и фазе полного выздоровления. Были исследованы образцы плазмы периферической крови 56 больных COVID-19, 69 реконвалесцентов и 10 практически здоровых лиц. Методом мультиплексного анализа по технологии xMAP определяли концентрации 46 молекул: IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-12 (p40), IL-12 (p70), IL-13, IL-15, IL-17A/CTLA8, IL-17-E/IL-25, IL-17F, IL-18, IL-22, IL-27, IFNα2, IFNγ, TNFα, TNFβ/Lymphotoxin-α (LTA), CCL2/MCP-1, CCL3/MIP-1α, CCL4/MIP-1β, CCL7/MCP-3, CCL11/Eotaxin, CCL22/MDC, CXCL1/GROα, CXCL8/IL-8, CXCL9/MIG, CXCL10/IP-10, CX3CL1/ Fractalkine, IL-1ra, IL-10, EGF, FGF-2/FGF-basic, Flt3 Ligand, G-CSF, M-CSF, GM-CSF, PDGF-AA, PDGF-AB/BB, TGF-α, VEGF-A.
В плазме крови больных COVID-19, находящихся в острой фазе заболевания по сравнению с контрольной группой, обнаружены достоверно повышенные уровни для 18 цитокинов: IL-6, IL-7, IL-15, IL-27, TNFα, TNFβ/Lymphotoxin-α (LTA), CCL2/MCP-1, CCL7/MCP-3, CXCL1/GROα, CXCL8/ IL-8, CXCL10/IP-10, CXCL9/MIG, IL-1rа, IL-10, M-CSF, GM-CSF, VEGF-A. В группе реконвалесцентов, по сравнению с больными COVID-19, у которых заболевание протекало со средней и тяжелой/крайне тяжелой формами течения, обнаружено достоверное снижение содержания практически всех исследованных нами цитокинов. Причем в плазме крови реконвалесцентов выявлены достовер но сниженные уровни 8 цитокинов по сравнению со значениями контрольной группы: IL-1α, IL-2, IL-9, IL-12 p40, IL-18, CCL22/MDC, Flt3 Ligand, TGF-α.
Иммунологическая реакция, вызванная заражением SARS-CoV-2, вовлекает многочисленные цитокины, преимущественно провоспалительного характера. Нами впервые показано, что фаза реконвалесценции характеризуется значительно сниженным уровнем цитокинов, которые регулируют дифференцировку клеток, гемопоэз, в особенности лимфоцитарное звено (Т-лимфоциты, NK-клетки). В острую фазу заболевания уровень этих цитокинов не меняется. Значительное снижение в фазу реконвалесценции по сравнению с острой фазой выявлено для подавляющего большинства цитокинов в плазме крови. Наоборот, острая фаза заболевания сопровождается значительно повышенным уровнем провоспалительных и противовоспалительных цитокинов в плазме крови.
Экспансия миелоидных супрессорных клеток (МС) вследствие нарушения дифференцировки миелоидных предшественников в условиях воспаления описана при ряде аутоиммунных заболеваний, включая ревматоидный артрит, системную красную волчанку и сахарный диабет 1-го типа. Учитывая, что при анкилозирующем спондилите (АС) повышенная концентрация провоспалительных медиаторов может также вызывать нарушения миелопоэза, изучение роли МС при данной патологии представляется актуальной задачей. Целью настоящей работы явилось исследование количественного содержания субпопуляций МС у больных с различными клиническими фенотипами и активностью АС. В исследование были рекрутированы 37 пациентов, включая 10 больных, не имеющих поражения периферического скелета (центральная форма) и 27 пациентов с одновременным поражением позвоночника и периферических суставов (периферическая форма). Контрольную группу составили 32 сопоставимых по полу и возрасту донора. Оценку гранулоцитарных (LinHLA-DRCD33+CD66b+; Г-МС), моноцитарных (CD14+HLA-DRlow/-; М-МС) и МС ранних стадий дифференцировки (LinHLA-DRCD33+CD66b- ; Р-МС) проводили методом проточной цитометрии с использованием соответствующих антител (BD Biosciences, США) в популяции мононуклеарных клеток периферической крови методом проточной цитофлюориметрии. В целом по группе: пациенты с АС характеризовались повышенным относительным и абсолютным количеством М-МС (р = 0,00002 и р = 0,00003 соответственно) и Г-МС (р = 0,0002 и р = 0,0006 соответственно). Пол пациентов, возраст и экспрессия HLA-B27 не оказывали значимого влияния на содержание этих клеток в периферической крови. Увеличение медианных значений М-МС выявлялось как у пациентов с центральной (Ме 5,0 (3,2-6,3) против 2,4 (1,7-3,5) %; р = 0,001), так и периферической формой (Ме 5,0 (3,0-7,0) против 2,4 (1,7-3,5) %; р = 0,0002) АС. В то же время экспансия Г-МС наблюдалась только у пациентов с вовлечением периферических суставов (Ме 0,16 (0,07-0,3) % против 0,05 (0,04-0,09) %; р = 0,0001). Относительное содержанием Р-МС, М-МС и Г-МС при центральной форме АС находилось в прямой корреляционной зависимости с активностью заболевания (R = 0,58, р = 0,02; R = 0,73 р = 0,08 и R = 0,65 р = 0,04 соответственно). При периферической форме АС такой взаимосвязи не прослеживалось. Полученные данные свидетельствуют о причастности МС к патогенезу и фенотипической разнородности АС. При этом обнаруженная прямая корреляционная связь между содержанием МС и активностью заболевания позволяет предполагать снижение супрессорной активности и/или появление провоспалительной активности у МС, что требует дальнейших исследований.
Нейтрофилы играют важную роль в канцерогенезе, опосредуя воспаление, иммуносупрессию и метастазирование, а также показана двоякая роль нейтрофилов в регуляции ангиогенеза. Рак эндометрия является наиболее распространенным злокачественным новообразованием женской репродуктивной системы. С целью оценки ангиогенного потенциала в лизате нейтрофилов периферической крови больных раком эндометрия и с миомой матки (группа сравнения) методом ИФА оценивали уровень воспалительных и ангиогенных цитокинов (VEGF-A, IL-17A, IL-1β, IL-6). В ядерной фракции нейтрофилов определяли экспрессию ядерного фактора NF-kB. В исследуемых группах оценивали отношение нейтрофилов к лимфоцитам (NLR). Статистическую обработку полученных данных проводили с использование ПО Statistica 10.
Установлено отсутствие значимых изменений NLR при раке эндометрия, по сравнению с контролем, и при миоме. Экспрессия NF-kB и VEGF были повышены по сравнению с контролем на всех изученных стадиях рака эндометрия и при миоме матки. Наблюдалась изменение уровня NF-kB в нейтрофилах в зависимости от дифференцировки опухоли. Между содержанием VEGF и NF-kB в нейтрофилах выявлена регрессионная взаимосвязь. Нами выявлено повышение уровня IL-1β и IL-6 в нейтрофилах при миоме матки и на разных стадиях рака эндометрия по сравнению с контролем. Уровень IL-1β был выше в нейтрофилах пациенток с умеренной и низкой дифференцировкой опухоли в сравнении с высокой.
IL-17A в лизате нейтрофилов был значимо снижен при миоме матки и на разных стадиях рака эндометрия по сравнению с контролем.
Отмечена умеренная обратная корреляционная связь между содержанием в нейтрофилах VEGF и IL-6 (r = -0,426; p = 0,001); заметная обратная связь между VEGF и IL-17А (r = -0,615; p < 0,001).
Комбинация показателей IL-6 и IL-17А в лизате нейтрофилов (по результатам мультивариантного анализа) может быть использована для дифференциальной диагностики рака эндометрия и миомы матки.
Таким образом, различия в экспрессии нейтрофилами воспалительных и ангиогенных цитокинов, входящих в NF-kB-зависиый сигналинг, свидетельствует о приобретении проопухолевых функций нейтрофилами при прогрессировании рака эндометрия.
Одним из ключевых механизмов иммунопатогенеза распространенного заболевания – хронического пародонтита (ХП) – является активация цитокиновой сети. Поэтому неслучайно исследование протеомного (в том числе цитокинового) профиля слюны признано одним из глобальных направлений исследований в пародонтологии. Однако полученные многочисленные данные о содержании различных хемокинов в ротовой жидкости при ХП нередко противоречивы. Эта неоднозначность результатов может быть связана как с разнообразием методических подходов при определении цитокинов, так и с особенностями когорт обследованных пациентов, например с разной тяжестью заболевания. При этом большинство публикаций посвящено средне-тяжелым и тяжелым формам ХП. Кроме того, в систематических обзорах, метаанализах последних лет вопрос о клинической ценности хемокинов при ХП также не решен однозначно, что указывает на необходимость дальнейших исследований в этой области.
Целью настоящего исследования было установить клинико-диагностическое значение определения некоторых хемокинов в ротовой жидкости при хроническом пародонтите легкой степени. Работа была основана на исследование 18 пациентов с диагнозом хронический пародонтит легкой степени и 12 практических здоровых добровольцев с относительно интактным пародонтом. Диагноз был установлен на основании стандартных клинико-рентгенологических критериев. Всем проводили определение уровня 8 хемокинов (СXCL1, СXCL8, СXCL10, СXCL12, ССL2, ССL3, ССL5, ССL11) методом мультипараметрического флуоресцентного анализа с магнитными микросферами (технология xMAP, Luminex 200, США). Статистический анализ проводился с использованием непараметрических критериев. Для определения диагностической значимости изученных параметров применили ROC-анализ.
Было показано, что течение хронического пародонтита сопровождается повышением уровня СXCL1 в 5,5 раза, СXCL8 в 8,1 раза, СXCL12 – в 3,5 раза, ССL2 – в 2.7. При этом уровень других хемокинов в ротовой жидкости – СXCL10, ССL3, ССL5, ССL11 существенно не изменялся. Наблюдалось отсутствие корреляционных связей между отдельными параметрами в группе пациентов с хроническим пародонтитом, в отличие от контрольной группы, что, вероятно, отражает нарушение механизмов «сбалансированности» регуляции хемокинов. В ходе ROC-анализа были выявлены потенциальные биомаркеры ХП легкой степени. Диагностическая чувствительность и диагностическая специфичность составили для СXCL1 91 и 75% соответственно, СXCL8 и СXCL12 – 95 и 75%, ССL2 – 82 и 75%. Полученые данные свидетельствуют о том, что саливарные хемокины СXCL1, СXCL8, СXCL12, ССL2 могут рассматриваться в качестве потенциальных биомаркеров хронического пародонтита легкой степени.
В последние годы первичные иммунодефициты из разряда редко встречающихся заболеваний переходят в число заболеваний, с которыми может встретиться врач любой специальности. Первый случай первичных иммунодефицитных заболеваний (ПИДЗ) был выявлен в Чувашии в 1993 г. С тех пор на кафедре внутренних болезней с курсом клинической иммунологии Чувашского государственного университета имени И.Н. Ульянова ведется регистрация всех диагностированных в регионе случаев ПИДЗ с внесением их в Республиканский регистр ПИДЗ. Целью настоящего исследования явилось изучение эпидемиологических показателей, клинико-лабораторных проявлений ПИДЗ на территории Чувашии. Материалом исследования служили данные о больных, полученные в ходе ретроспективного анализа 85 историй болезни больных ПИДЗ, находившихся на стационарном лечении в различных отделениях БУ «Республиканская клиническая больница» и БУ «Городская детская клиническая больница» Минздрава Чувашии в 2000-2019 гг., а также 49 амбулаторных карт пациентов, включенных в региональный регистр ПИДЗ. Диагностику различных форм ПИДЗ осуществляли в соответствии с критериями, разработанными Европейским Обществом по имму нодефицитам и Панамериканской группой по иммунодефицитам (1999). Результаты исследования показали, что частота распространенности ПИДЗ в регионе составляет 3,4:100 000. Заболеваемость наиболее распространенной формы ПИДЗ в регионе – общей вариабельной иммунной недостаточности (ОВИН) – составила 1,58 на 100 000 населения. Средний возраст на момент постановки диагноза ОВИН у больных Чувашии равнялся 30,4±16,1 годам, возраст дебюта ОВИН – 11,3±15,0 годам. Задержка постановки диагноза с момента клинической манифестации ОВИН составила в регионе в среднем 17,9 лет. На момент выставления диагноза ОВИН у больных обнаруживалось выраженное снижение уровней иммуноглобулинов 3-х или 2-х классов (IgG и IgА) и содержания в периферической крови Т-хелперных клеток (CD3+CD4+). Показатель распространенности селективного дефицита IgA, проявляющегося клинически, составил 0,83 на 100 000 населения региона, частота встречаемости бессимптомной формы данного ПИДЗ – 1:167. У пациентов с селективным дефицитом IgА обнаруживались нарушения в Т-клеточной системе, проявляющиеся в уменьшении относительного числа цитотоксических Т-клеток. Уровни IgG и IgМ оказались повышены. Возраст постановки диагноза X-сцепленной агаммаглобулинемии в регионе составил 3,5±3,0 года. Помимо нарушения в гуморальном звене адаптивного иммунитета у детей с данным заболеванием выявлялось уменьшение абсолютного числа Т-лимфоцитов. В заключение приведено описание нарушения поствакцинального иммунитета у беременной пациентки с ОВИН, бессимптомное течение которой привело к ложной трактовке показателей серологических маркеров ТОРЧ-инфекций и ошибкам в тактике ведения беременности.
Изучали связь полиморфизма гена HLA-G (rs41551813, rs12722477 и rs41557518), внутриматочной инфекции и невынашивания беременности у женщин. Исследуемую группу (НБ) составили 180 женщин с невынашиванием беременности, определяемой как два и более повторяющихся самопроизвольных выкидыша (min = 2; max = 8) до 20 недель беременности. На момент обследования женщины были не беременными и наблюдались в медико-генетической консультации г. Кемерово. Каждая женщина прошла гинекологическое обследование. Из исследования были исключены женщины с медицинскими абортами, родами и внематочными беременностями, с сахарным диабетом. Для исключения других известных причин самопроизвольного выкидыша были проведены ультразвуковое исследование органов малого таза и кариотипирование женщины и мужчины. Средний возраст женщин составил 29,6±4,8 (SD) лет. Группа сравнения (контроль) включала 408 здоровых и фертильных женщин. Критериями включения в исследование для них были роды 1-2 здоровых детей. Средний возраст женщин составил 26,8±5,2 (SD) лет. Влияние инфекционного фактора анализировали на основании лабораторных тестов: микроскопического исследования (для выявления бактериального вагиноза и вульво-вагинального кандидоза); иммуноферментного анализа и полимеразно-цепной реакции (для выявления генитального герпеса, цитомегаловируса, вируса папиломы человека типа 16/18; Chlamydia trachomatis, Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum и Gardnerella vaginalis; и Trichomonas vaginalis. Данные были получены из медицинских карт обследуемых женщин. Все женщины дали письменное информированное согласие на участие в исследовании. Типирование полиморфизма Thr31Ser (rs41551813, HLA-G*01:03) в экзоне 2, Leu110Ile (rs12722477, HLA-G*01:04) и 1597 delС (rs41557518, HLA-G*01:05N) в экзоне 3 гена HLA-G проводили методом асимметричной ПЦР в режиме реального времени. Как показало исследование, у обследуемых женщин внутриматочная инфекция не являлась самостоятельно значимым фактором риска НБ (p = 0,30). Обнаружено, что аллель 110 Ile (HLA-G*01:04) являлся фактором риска НБ как у женщин с внутриматочной инфекцией (ORa = 4,50 [2,41-8,38], p = 2,09e-06), так и у женщин без инфекции (ORa = 2,46 [1,44-4,21], p = 0,0009). Выявлено совместное влияние генетического и инфекционного факторов с риском НБ у женщин (ORa+f = 3,50 [2,01-6,09], p = 8,78e-06). Наши результаты могут быть полезны в понимании молекулярных механизмов иммунных нарушений в системе мать-плод и при выборе тактики ведения и лечения женщин с НБ.
Для лечения пациентов с онкологическими заболеваниями в последние годы активно развиваются методы клеточной иммунотерапии. Наиболее актуальным становится применение противоопухолевой адоптивной (от англ. adopt – принимать, усыновлять) иммунотерапии (АИТ) на основе активированных in vitro лимфоцитов и клеток натуральных киллеров (NK-клеток), противоопухолевый потенциал которых усиливают с помощью культивирования in vitro в присутствии цитокинов. При инкубации in vitro мононуклеаров периферической крови пациентов с цитокинами получают цитокин-индуцированные киллеры (ЦИК). Именно они являются одним из важных компонентов противоопухолевой защиты и могут использоваться для АИТ. В настоящее время исследования в области противоопухолевой АИТ продолжаются, идет поиск высокотехнологичных и безопасных методов клеточной иммунотерапии в онкологии. В статье представлены результаты in vitro активации лимфоцитов периферической крови 19 онкологических больных двумя способами. В присутствии интерлейкинов: IL-2, IL-12 и в присутствии интерлейкинов: IL-2 и IL-15. Методом ИФА выявлены различия в секреции цитокинов (IL-2, IL-4, IL-6 и IL-10, IFNα и IFNγ и TNFα) активированными in vitro лимфоцитами. Показано, что для более ранней активации клеток in vitro необходимо применять IL-15. Изучена способность клеток цельной крови 20 онкологических больных, после проведения клеточной иммунотерапии и без нее, а также 10 здоровых доноров секретировать цитокины in vitro при спонтанном и митоген-индуцированном способе культивирования. Установлено, что клетки периферической крови онкологических больных, получающих АИТ на протяжении года и более, обладают большей способностью реагировать на стимуляцию митогеном, в отличие от больных, которым АИТ никогда не проводили, а так же относительно группы доноров, иммунная система которых также не подвергалась стимуляции. Вероятнее это можно объяснить тем, что при введении активированных in vitro ЦИК в организме пациента запускается ряд каскадных реакций межклеточного взаимодействия, приводящих к активации клеток иммунной системы пациента, а именно противоопухолевого иммунитета, пролиферации цитотоксических лимфоцитов и NK-клеток, и подавления иммуносупрессии in vivo. Разработанный способ получения ЦИК может быть рекомендован для проведения клеточной АИТ онкологическим больным, как новый подход к активации клеток иммунной системы больного in vivo.
КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ
Данные Всемирной организации здравоохранения показывают, что каждый год около 11 млн человек испытывают потребность в получении медицинской помощи после ожогов. В общей структуре ожогов доля термической травмы (ТТ) составляет 80%. Лимфоцитопения при ТТ – фактор риска инфекционных осложнений и ограничения репарации, а разработка новых средств терапии ТТ с использованием дермальных пленок востребована в современной комбустиологии. Цель исследования – провести оценку изменения показателей лимфоцитов крови – количественного состава и их гибели при экспериментальном термическом повреждении в условиях применения оригинальной дермальной пленки с мелатонином (МТ) – достигнута на 49 крысах линии Wistar. ТТ IIIА степени и площадью 3,5% моделировалась путем контакта с кипящей водой в течение 12 с. Дермальные пленки на основе натрия карбоксиметилцеллюлозы с МТ в концентрации 0,005 г/г применяли ежедневно в течение 5 суток. В крови оценивалось общее количество лимфоцитов, количество СD45RA+ и CD3+, количество лимфоцитов с признаками частичного некроза, раннего и позднего апоптоза. Рассчитывали относительное уменьшение площади и скорость эпителизации ожоговой раны. При ТТ на 5-е, 10-е и 20-е сутки в крови количество лимфоцитов уменьшается, включая CD45RA+ и CD3+, количество лимфоцитов с признаками некроза, позднего и раннего апоптоза увеличивается. Площадь ожоговой раны к 20-м суткам уменьшается на 11,5%. Применение дермальных пленок с МТ увеличивает в крови на 5-е и 10-е сутки количество CD3+, на 5-е, 10-е и 20-е сутки – CD45RA+, вызывает снижение количества лимфоцитов с признаками раннего апоптоза на 5-е, 10-е и 20-е сутки, также c признаками некроза и позднего апоптоза – на 5-е сутки ТТ, ускоряет заживление ожоговой раны на 5-е, 10-е и 20-е сутки ТТ с уменьшением ее площади на 20-е сутки на 20%. Скорость эпителизации ожоговой раны в условиях применения дермальной пленки с МТ на 5-е, 10-е и 20-е сутки увеличивается по мере увеличения в крови количества CD3+ и снижения количества лимфоцитов с признаками раннего апоптоза.
Известно, что при хроническом воздействии паров металлической ртути наблюдаются изменения в клеточном и гуморальном звеньях иммунной системы. В динамике развития и течения хронической ртутной интоксикации (ХРИ) в предыдущих исследованиях нами выявлены выраженные закономерные изменения медиаторов воспаления (IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, TNFα), показана важная роль аутоиммунных реакций относительно белков нервной ткани. В последние годы возрастает интерес к открытому в начале XXI века интерлейкину 17 (IL-17) при ряде воспалительных и аутоиммунных заболеваний. Однако сведения о роли его при нейроинтоксикации ртутью отсутствуют. Учитывая, что IL-17 обладает провоспалительной активностью и стимулирует выработку отдельных цитокинов, на следующем этапе исследований целью работы явилось выявление изменений концентрации IL-17 в сыворотке крови у пациентов с нейроинтоксикацией ртутью различной степени выраженности для обоснования дополнительных критериев ранней и эффективной диагностики заболевания. Проведено обследование мужчин, подвергавшихся хроническому воздействию паров металлической ртути и имеющих ранние признаки нейроинтоксикации парами металлической ртути (n = 37), лиц с установленным диагнозом ХРИ (n = 40) и «условно здоровых» мужчин (n = 34). Критериями включения в основные группы являлось наличие установленного во время работы в контакте с вредным производственным фактором диагноза, отсутствие коморбидной патологии. Статистическую обработку результатов проводили с помощью пакета прикладных программ STATISTICA 6.0 (StatSoft, США). В результате исследования установлено статистически значимое возрастание сывороточных концентраций IL-17 как у пациентов с ранними проявлениями нейроинтоксикации парами металлической ртути, так и у лиц с ХРИ при сопоставлении с группой сравнения, что свидетельствует о его активации и согласуется с результатами отдельных авторов, свидетельствующих о возрастании IL-17 при иммуновоспалительных заболеваниях. Результаты корреляционного анализа продемонстрировали связь между IL-17 и медиаторами воспаления (у пациентов с ранними признаками нейроинтоксикации возрастание продукции IL-17 сопровождалось нарастанием антивоспалительного IL-10, а у лиц с ХРИ при увеличении концентрации IL-17 наблюдалось снижение провоспалительного TNFα), что подтверждает его роль в иммунопатогенезе нейроинтоксикации парами ртути. Дальнейшее изучение участия IL-17 в инициации и поддержании хронического воспаления будет не только способствовать лучшему пониманию природы болезни, но и, самое главное, появлению новых, более эффективных методов лечения.
ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
Активированные тромбоциты образуют комплексы с циркулирующими лейкоцитами посредством мембраносвязанных молекул. Взаимодействие тромбоцитов с моноцитами лежат в основе патофизиологических механизмов, связывающих процессы тромбообразования и воспаления. Определение и анализ тромбоцитарно-моноцитарных комплексов (ТМК) позволяет выявить их физиологическую и патогенетическую роль, а также имеет важное диагностическое значение при изучении различных патологических состояний, в том числе, акушерских. Цель исследования состояла в разработке метода определения количественного содержания ТМК в периферической крови, позволяющего сохранить основные фенотипические характеристики тромбоцитов и моноцитов, и выявить их изменения при анализе биоматериала ex vivo. Предлагаемый метод сочетает в себе немедленную фиксацию образцов крови, иммуноцитохимическое флуоресцентное окрашивание дифференцировочных и активационных маркеров тромбоцитов и моноцитов с последующим лизисом эритроцитов и анализ с помощью проточной цитофлуориметрии. Было исследовано 14 образцов периферической крови, полученных от пациенток с отягощенным акушерским анамнезом, в первом триместре текущей беременности. Показано, что процедура фиксации позволяет сохранить количественные и качественные характеристики ТМК, существующие in vivo, тогда как при отсутствии фиксации наблюдается многократное увеличение количества ТМК и уровня экспрессии активационных маркеров тромбоцитов и моноцитов ex vivo. Используемая панель моноклональных антител и примененные стратегии гейтирования обеспечивают оценку относительного и абсолютного количества ТМК и их фенотипических характеристик как в общей популяции (CD45+CD14+) моноцитов, так и в субпопуляциях «классических» (CD14+CD16-), «промежуточных» (CD14+CD16+) и «неклассических» (CD14lowCD16+) моноцитов. Выработанный подход позволяет оценить вклад отдельных субпопуляций моноцитов в формирование ТМК и степень их участия в физиологических и патофизиологических процессах. В отдельных образцах было выявлено увеличение количества ТМК, сопровождавшееся существенным повышением в них экспрессии активационного маркера тромбоцитов CD62P и снижением экспрессии его моноцитарного лиганда CD162. Данные изменения могут свидетельствовать об изменении активационного статуса комплексообразующих клеток и возможном участии ТМК в патофизиологических механизмах некоторых акушерских осложнений. Иммунофенотипирование ТМК позволяет дополнительно охарактеризовать их провоспалительный, прокоагулянтный и адгезионный потенциал и может быть применено как в фундаментальных исследованиях, так и в целях диагностики. В частности, данный метод может быть использован для определения и характеристики ТМК при акушерских осложнениях, сопровождающихся воспалением и нарушениями гемостаза.
ISSN 2313-741X (Online)