Влияние GcMAF-RF на ex vivo поляризацию макрофагов, активацию дендритных клеток и продукцию цитокинов клетками цельной крови человека

Данная статья представляет собой второе сообщение из серии статей, посвященных получению отечественного препарата макрофаг-активирующего фактора (GcMAF-RF) и оценке его биологических свойств. Целью данной работы являлось изучение воздействия препарата GcMAF-RF на М0 → М1 поляризацию макрофагов (Мф) и активацию профессиональных свойств антиген-презентирующих дендритных клеток (ДК), генерированных ex vivo, а также на ex vivo продукцию провоспалительных (TNFα, IL-1β, IL-6, IFNγ, IL-17, IL-18) и противовоспалительных (TGF-β, IL-4, IL-10) цитокинов, факторов роста (IL-2, GM-CSF, G-CSF, VEGF) и хемокинов (MCP, IL-8) клетками цельной крови здоровых доноров. Мф и ДК генерировали из моноцитов (3-5 × 106 /мл) прилипающей фракции мононуклеарных клеток (МНК) периферической крови здоровых доноров; при этом для получения Мф использовали гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (rhGM-CSF), а при получении ДК – GM-CSF и интерферон-α. В качестве М1-поляризующих сигналов использовали липополисахарид (LPS Е. coli 0114:B4) (контроль) либо препарат GcMAF-RF (опыт), которые добавляли за 48 ч до окончания культивирования. Стимулирующее влияние полученных Мф и ДК на пролиферацию клеток оценивали в аллогенной смешанной культуре лейкоцитов (алло-СКЛ) радиометрически по включению 3H-тимидина. Индекс влияния (ИВ) Мф или ДК на алло-СКЛ рассчитывали как отношение пролиферативного ответа МНК в присутствии Мф или ДК к уровню спонтанной пролиферации МНК. Для определения продукции цитокинов клетками цельной крови человека ex vivo использовали образцы периферической крови 3 доноров с двумя повторностями препарата GcMAF-RF, итого 6 вариантов. Все варианты исследования проведены на активированных митогеном и неактивированных клетках крови. Содержание цитокинов определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа. Для количественной оценки воздействия GcMAF-RF использован индекс влияния (ИВ) как отношение продукции цитокина в присутствии GcMAF-RF к уровню спонтанной продукции. Показано, что препарат GcMAF-RF эффективно, как и «стандартный» активатор Мф и ДК липополисахарид (LPS), индуцирует поляризацию дифференцированных М0-макрофагов в М1-клетки и конечное созревание ДК, что проявляется значимым усилением их аллостимуляторной активности в смешанной культуре лейкоцитов (алло-СКЛ). Кроме того, препарат GcMAF-RF стимулирует продукцию клетками крови (гранулоцитами, лимфоцитами, моноцитами) широкий спектр цитокинов и хемокинов (TNFα, IL-1β, IL-6, IL-18, IL-4, IL-10, GM-CSF, G-CSF, VEGF, IL-8), что свидетельствует о прямом участии активатора макрофагов GcMAF-RF в различных иммунных процессах. Таким образом, отечественный препарат GcMAF-RF индуцирует поляризацию макрофагов M0 → M1, конечное созревание ДК и аллостимулирующую активность Мф и ДК, а также способен эффективно стимулировать циркулирующие клетки крови к синтезу цитокинов/хемокинов с провоспалительной и иммунорегуляторной активностью. 

1. Кетлинский С.А., Симбирцев А.С. Цитокины. СПб: Фолиант, 2008. 552 c.

2. Козлова А.И., Воропаев Е.В., Конопля А.И. Роль дендритных клеток в формировании противоопухолевого иммунитета (обзор литературы) // Проблемы здоровья и экологии, 2015. C. 19-24.

3. Левитес Е.В., Кирикович С.С., Долгова Е.В., Проскурина А.С., Риттер Г.С., Останин А.А., Черных Е.Р., Богачев С.С. Оценка in vitro биологической активности отечественного препарата макрофаг-активирующего фактора (GcMAF-RF) // Вавиловский журнал генетики и селекции, 2020. Т. 24, № 3. С. 284-291.

4. Леплина О.Ю., Тихонова М.А., Козлов Ю.П., Ступак В.В., Никонов С.Д., Останин А.А., Черных Е.Р. Частично зрелые дендритные клетки как потенциальная основа для индукции противоопухолевого ответа у больных злокачественными глиомами // Медицинская иммунология, 2005. Т. 7, № 4. С. 365-374. doi: 10.15789/1563-0625-2005-4-365-374.

5. Леплина О.Ю., Тихонова М.А., Тыринова Т.В., Алямкина Е.А., Богачев С.С., Останин А.А., Черных Е.Р. Функциональная активность IFNα- и IL-4-индуцированных дендритных клеток человека: сравнительное исследование // Медицинская иммунология, 2014. Т. 16, № 1. С. 43-52. doi: 10.15789/1563-0625-2014-1-43-52.

6. Монастырская Е.А., Лямина С.В., Малышев И.Ю. М1 и М2 фенотипы активированных макрофагов и их роль в иммунном ответе и патологии // Патогенез, 2008. Т. 6, № 4. С. 31-39.

7. Останин А.А., Кирикович С.С., Долгова Е.В., Проскурина А.С., Черных Е.Р., Богачев С.С. Тернистый путь макрофаг-активирующего фактора (GcMAF): от открытия к клинической практике // Вавиловский журнал генетики и селекции, 2019. Т. 23, № 5. С. 624-631.

8. Рыжикова С.Л., Дружинина Ю.Г., Рябичева Т.Г., Вараксин Н.А. Стандартизация методики определения продукции цитокинов клетками крови ex vivo // Клиническая лабораторная диагностика, 2011. Т. 11. С. 49-53.

9. Сахно Л.В., Шевела Е.Я., Тихонова М.А., Останин А.А., Черных Е.Р. Молекулярные механизмы иммуносупрессорной активности М2-макрофагов // Иммунология, 2016. Т. 37, № 6. С. 311-315.

10. Талаев В.Ю., Плеханова М.В., Матвеичев А.В. Экспериментальные модели, пригодные для оценки влияния компонентов новых разрабатываемых вакцин на дифференцировку дендритных клеток // Медиаль, 2014. Т. 2, № 12. С. 135-153.

11. Черных Е.Р., Леплина О.Ю., Тыринова Т.В., Тихонова М.А., Ступак В.В., Мишинов С.В., Пендюрин И.В., Останин А.А. Противоопухолевая активность дендритных клеток здоровых доноров и больных с опухолями головного мозга // Медицинская иммунология, 2010. Т. 12, № 3. С. 199-206.

12. Черных Е.Р., Тыринова Т.В., Леплина О.Ю., Тихонова М.А., Курочкина Ю.Д., Олейник Е.А., Сахно Л.В., Останин А.А. Фенотип и функции дендритных клеток человека, генерированных из субпопуляций моноцитов CD14+, оппозитных по экспрессии CD16 // Бюллетень сибирской медицины, 2019. Т. 18, № 1. С. 266-276.

13. Шевела Е.Я., Янковская А.А., Сахно Л.В., Останин А.А., Черных Е.Р. Патент. РФ 2717024 Способ идентификации функционального М1 и М2 фенотипа макрофагов человека, генерированных in vitro из моноцитов крови / № 2019118746, заявл. 17.06.2019; опубл. 17.03.2020, Бюл. № 8.

14. Banchereau J., Steinman R.M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature, 1998, Vol. 392, no. 6673, pp. 245-252.

15. Blanco P., Palucka A.K., Pascual V., Banchereau J. Dendritic cells and cytokines in human inflammatory and autoimmune diseases. Cytokine Growth Factor Rev., 2008, Vol. 19, no. 1, pp. 41-52.

16. Cassetta L., Cassol E., Poli G. Macrophage polarization in health and disease. Sci. World J., 2011, Vol. 11, pp. 2391-2402.

17. Cheda A., Nowosielska E.M., Wrembel-Wargocka J., Janiak M.K. Production of cytokines by peritoneal macrophages and splenocytes after exposures of mice to low doses of X-rays. Radiat. Environ. Biophys., 2008, Vol. 47, pp. 275-283.

18. Duque G.A., Descoteaux A. Macrophage cytokines: involvement in immunity and infectious diseases. Front. Immunol., 2014, Vol. 5, 491. doi: 10.3389/fimmu.2014.00491.

19. Fleetwood A.J., Lawrence T., Hamilton J.A., Cook A.D. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (CSF) and macrophage CSF-dependent macrophage phenotypes display differences in cytokine profiles and transcription factor activities: implications for CSF blockade in inflammation. J. Immunol., 2007, Vol. 178, no. 8, pp. 5245-5252.

20. Fogg D.K., Sibon C., Miled C., Jung S., Aucouturier P., Littman D.R., Cumano A., Geissmann F.A. Clonogenic bone marrow progenitor specific for macrophages and dendritic cells. Science, 2006, Vol. 311, no. 5757, pp. 83-87.

21. Geissmann F., Gordon S., Hume D.A., Mowat A.M., Randolph G.J. Unravelling mononuclear phagocyte heterogeneity. Nat. Rev. Immunol., 2010, Vol. 10, no. 6, pp. 453-460.

22. Gordon S. Alternative activation of macrophages. Nat. Rev. Immunol., 2003, Vol. 3, pp. 23-35.

23. Gordon S., Taylor P.R. Monocyte and macrophage heterogeneity. Nat. Rev. Immunol., 2005, Vol. 5, no. 12, pp. 953-964.

24. Homma S., Yamamoto M., Yamamoto N. Vitamin D-binding protein (group-specific component) is the sole serum protein required for macrophage activation after treatment of peritoneal cells with lysophosphatidylcholine. Immunol. Cell Biol., 1993, Vol. 71, pp. 249-257.

25. Hume D.A. Macrophages as APC and the dendritic cell myth. J. Immunol., 2008, Vol. 181, no. 9, pp. 5829-5835.

26. Inui T., Kuchiike D., Kubo K., Mette M., Uto Y., Hori H., Sakamoto N. Clinical experience of integrative cancer immunotherapy with GcMAF. Anticancer Res., 2013, Vol. 33, no. 7, pp. 2917-2919.

27. Ishikawa M., Inoue T., Inui T., Kuchiike D., Kubo K., Uto Y., Nishikata T. A novel assay system for macrophageactivating factor activity using a human U937 cell line. Anticancer Res., 2014, Vol. 34, no. 8, pp. 4577-4581.

28. Jaguin M., Houlbert N., Fardel O., Lecureur V. Polarization profiles of human M-CSF-generated macrophages and comparison of M1-markers in classically activated macrophages from GM-CSF and M-CSF origin. Cell. Immunol., 2013, Vol. 281, pp. 51-61.

29. Kisker O., Onizuka S., Becker C.M., Fannon M., Flynn E., d’Amato R., Zetter B., Folkman J., Ray R., Swamy N., Pirie-Shepherd S. Vitamin D binding protein-macrophage activating factor (DBP-maf) inhibits angiogenesis and tumor growth in mice. Neoplasia, 2003, Vol. 5, no. 1, pp. 32-40.

30. Kroemer G., Galluzzi L., Kepp O., Zitvogel L. Immunogenic cell death in cancer therapy. Annu. Rev. Immunol., 2013, Vol. 31, pp. 51-72.

31. Kuchiike D., Uto Y., Mukai H., Ishiyama N., Abe C., Tanaka D., Kawai T., Kubo K., Mette M., Inui T., Endo Y., Hori H. Degalactosylated/desialylated human serum containing GcMAF induces macrophage phagocytic activity and in vivo antitumor activity. Anticancer Res., 2013, Vol. 33, no. 7, pp. 2881-2885.

32. Kurosaka K., Takahashi M., Kobayashi Y. Activation of extracellular signal-regulated kinase 1/2 is involved in production of CXC-chemokine by macrophages during phagocytosis of late apoptotic cells. Biochem. Biophys. Res. Commun., 2003, Vol. 306, no. 4, pp. 1070-1074.

33. Lamagna C., Aurrand-Lions M., Imhof B.A. Dual role of macrophages in tumor growth and angiogenesis. J. Leukoc. Biol., 2006, Vol. 80, no. 4, pp. 705-713.

34. Martinez F.O., Sica A., Mantovani A., Locati M. Macrophage activation and polarization. Front. Biosci., 2008, Vol. 1, no. 13, pp. 453-461.

35. Mohamad S.B., Nagasawa H., Uto Y., Hori H. Tumor cell alpha-N-acetylgalactosaminidase activity and its involvement in GcMAF-related macrophage activation. Comp. Biochem. Physiol. A Mol. Integr. Physiol., 2002, Vol. 132, pp. 1-8.

36. Murray P.J., Wynn T.A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nat. Rev. Immunol., 2011, Vol. 11, no. 11, pp. 723-737.

37. Nagasawa H., Uto Y., Sasaki H., Okamura N., Murakami A., Kubo S., Kirk K.L., Hori H. Gc protein (vitamin D-binding protein): Gc genotyping and GcMAF precursor activity. Anticancer Res., 2005, Vol. 25, no. 6, pp. 3689-3696.

38. Nagy L., Szanto A., Szatmari I., Szeles, L. Nuclear hormone receptors enable macrophages and dendritic cells to sense their lipid environment and shape their immune response. Physiol. Rev., 2012, Vol. 92, pp. 739-789.

39. Naraparaju V.R., Yamamoto N. Roles of β-galactosidase of B lymphocytes and sialidase of T lymphocytes in inflammation-primed activation of macrophages. Immunol. Lett., 1994, Vol. 43, no. 3, pp. 143-148.

40. O’Shea J.J., Siegel R.M. Cytokines and cytokine receptors. Clinical immunology. Ed. Rich R.R., Fleisher T.A., Shearer W.T., Schroeder H.W., Frew A.J., Weyand C.M. Elsevier, 2019, pp. 127-155.

41. Rehder D.S., Nelson R.W., Borges C.R. Glycosylation status of vitamin D binding protein in cancer patients. Protein Sci., 2009, Vol. 18, no. 10, pp. 2036-2042.

42. Roszer T. Understanding the mysterious M2 macrophage through activation markers and effector mechanisms. Mediators Inflamm., 2015, Vol. 2015, 816460. doi: 10.1155/2015/816460.

43. Saburi E., Saburi A., Ghanei M. Promising role for Gc-MAF in cancer immunotherapy: from bench to bedside. Casp. J. Intern. Med., 2017, Vol. 8, no. 4, pp. 228-238.

44. Sica A., Bronte V. Altered macrophage differentiation and immune dysfunction in tumor development. J. Clin. Invest., 2007, Vol. 117, no. 5, pp. 1155-1166.

45. Tarique A.A., Logan J., Thomas E., Holt P.G., Sly P.D., Fantino E. Phenotypic, functional, and plasticity features of classical and alternatively activated human macrophages. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 2015, Vol. 53, no. 5, pp. 676-688.

46. Thyer L., Ward E., Smith R., Branca J.J.V., Morucci G., Gulisano M., Noakes D., Eslinger R., Pacini S. GC protein-derived macrophage-activating factor decreases α-N-acetylgalactosaminidase levels in advanced cancer patients. Oncoimmunology, 2013, Vol. 2, no. 8, pp. 1-7.

47. Thyer L., Ward E., Smith R., Fiore M., Magherini S., Branca J., Morucci G., Gulisano M., Ruggiero M., Pacini S. A novel role for a major component of the vitamin d axis: vitamin d binding protein-derived macrophage activating factor induces human breast cancer cell apoptosis through stimulation of macrophages. Nutrients, 2013, Vol. 5, no. 7, pp. 2577-2589.

48. Weagel E., Smith C., Liu P., Robinson R., O’Neill K. Macrophage polarization and its role in cancer. J. Clin. Cell Immunol., 2015, Vol. 6, pp. 4-11.

49. Yamamoto N., Homma S. Vitamin D3 binding protein (group-specific component) is a precursor for the macrophage-activating signal factor from lysophosphatidylcholine-treated lymphocytes. Proc. Natl. Acad. Sci., 1991, Vol. 88, no. 19, pp. 8539-8543.

50. Yamamoto N., Kumashiro R. Conversion of vitamin D3 binding protein (group-specific component) to a macrophage activating factor by the stepwise action of beta-galactosidase of B cells and sialidase of T cells. J. Immunol., 1993, Vol. 151, no. 5, pp. 2794-2802.

51. Yamamoto N., Naraparaju V.R., Asbell S.O. Deglycosylation of serum vitamin D3-binding protein leads to immunosuppression in cancer patients. Cancer Res., 1996, Vol. 56, no. 12, pp. 2827-2831.

52. Yamamoto N., Suyama H., Yamamoto N. Immunotherapy for prostate cancer with Gc protein-derived macrophage-activating factor, GcMAF. Transl. Oncol., 2008, Vol. 1, pp. 65-72.

53. Yaraee R., Askari N., Naseri M. The effect of ms14 on production of pro-inflammatory cytokines by macrophages. Iran. J. Basic Med. Sci., 2011. Vol. 14, no. 1, pp. 89-93.

54. Zhang G.-M., Wang X.-H., Sun L.-J. Effect of tacrolimus on maturity and allostimulatory activity of cultured dendritic cells of rats in vitro. Chinese Journal of Pharmacology and Toxicology, 2009, Vol. 23, no. 5, pp. 345-350.

55. Zhou F., Zhang G-X., Rostami A. Distinct role of IL-27 in immature and LPS-induced mature dendritic cell-mediated development of CD4+CD127+3G11+ regulatory T cell subset. Front. Immunol., 2018, Vol. 9, 2562. doi 10.3389/fimmu.2018.02562.