АНАЛИЗ ЦИТОАРХИТЕКТОНИКИ TLR2⁺ И TLR4⁺ ЛИМФОЦИТОВ И ТРАНСКРИПЦИОННОЙ АКТИВНОСТИ ГЕНОВ Gp2, Spi-B, Nf-kB1, с-REL, TNFα И TNFr В КАЛТ КРЫС ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ САХАРНОМ ДИАБЕТЕ И ПОСЛЕ ВВЕДЕНИЙ ПЕНТОКСИФИЛЛИНА

Критически важными в развитии СД 1 типа являются изменения состояния кишечно-ассоциированной лимфоидной ткани (КАЛТ) и состава микробиома кишечника как в условиях экспериментального STZ-индуцированного диабета, так и при развитии СД 1 типа у людей и хронического воспаления за счет стимуляции врожденного звена иммунитета. Одним из наиболее важных посредников во взаимодействии между кишечным микробиомом и КАЛТ являются специализированные М-клетки фолликул-ассоциированного эпителия, обеспечивающие трансцитотическую доставку антигенов подлежащим лимфоидным структурам. Вспомогательную роль в образовании М-клеток играет и TNFα-сигнализация. Поэтому целью нашей работы было изучение особенностей экспрессии TLRs и транскрипционной активности генов Gp2, Spi-B, Nf-kB1, с-Rel, TNFα и TNFr в КАЛТ при экспериментальном сахарном диабете (ЭСД) и после введения пентоксифиллина. Для идентификации TLR2⁺ клеток и TLR4⁺ клеток применяли иммунофлюоресцентный метод с использованием моноклональных антител к соответствующим паттерн-распознающим рецепторам. Для изучения транскрипционной активности генов использовали метод полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в режиме реального времени (ОТ-ПЛР). В ходе развития экспериментальной патологии длительностью 2 и 4 недели наблюдалось снижение суммарной плотности TLR2⁺ и TLR4⁺ лимфоцитов в СПСОВ и ИЛФ подвздошной кишки крыс. При этом плотность TLR2 на мембране иммунопозитивных клеток увеличивалась у малых, а TLR4 – у средних и малых лимфоцитов. Введение пентоксифиллина диабетическим крысам приводило к снижению суммарной плотности TLR2⁺ клеток на 2-й неделе развития патологии и к увеличениию данного показателя на 4-й неделе. Суммарная плотность TLR4⁺ клеток демонстрировала динамику к росту только в СПСОВ на 2-й неделе развития ЭСД на фоне введения пентоксифиллина. Изменения плотности TLR2 иTLR4 на поверхности лимфоцитов носили разнонаправленный характер. Развитие диабета нашло свое отражение и в транскрипционной индукции генов ключевых транскрипционных факторов NF-kB1 и c-Rel в клетках КАЛТ как на 2-й, так и на 4-й неделе развития ЭСД. Тогда как введение пентоксифиллина достоверно снижало уровень нормализованной экспресии мРНК NF-kB1 в течение всего срока наблюдений и увеличивало данный показатель для мРНК c-Rel на 2-й неделе. Отмечен рост нормализованной экспресии маркеров М-клеток Gp2 и Spi-B как на 2-й, так и на 4-й неделе развития экспериментальной патологии. Введение пентоксифиллина диабетическим животным в большей степени нашло свое отражение в изменении интенсивности экспрессии мРНК маркера зрелых М-клеток Gp2 – данный показатель увеличивался на 2-й неделе развития патологии, а на 4-й демонстрировал динамику к снижению. Развитие ЭСД приводило к достоверному повышению уровня нормализованной экспрессии провоспалительного цитокина TNFα и его рецептора TNFr и демонстрировало динамику к снижению на фоне введения пентоксифиллина диабетическим животным.

1. Деген А.С., Камышный А.М. Экспрессия цитоплазматических NOD-2 и RIG-I рецепторов врожденного иммунитета в кишечнике крыс при экспериментальном сахарном диабете // Российский иммунологический журнал, 2014. № 3. С. 525-528.

2. Alyanakian M.A., Grela F., Aumeunier A., Chiavaroli C., Gouarin C., Bardel E., Normier G., Chatenoud L., Thieblemont N., Bach J.F. Transforming growth factor-beta and natural killer T-cells are involved in the protective effect of a bacterial extract on type 1 diabetes. Diabetes, 2006, Vol. 55, no. 1, pp. 179-185.

3. Biswas A., Banerjee P., Biswas T. Porin of Shigella dysenteriae directly promotes toll-like receptor 2-mediated CD4 + T cell survival and effector function. Mol. Immunol., 2009, Vol. 46, no. 15, pp. 3076-3085.

4. d’Addio F., Fiorina P. Type 1 diabetes and dysfunctional intestinal homeostasis. Trends Endocrinol. Metab., 2016, Vol. 27, no. 7, pp. 493-503.

5. Degen A., Kamyshny A. Distribution characteristics of RIG-I receptors of innate immunity in experimental diabetes mellitus and administration of nonspecific blockers of TNF-α. J. Immunol. Clin. Microbiol., 2018, Vol. 3, no. 3, pp. 50-59.

6. Devaraj S., Dasu M.R., Rockwood J., Winter W., Griffen S.C., Jialal I. Increased toll-like receptor (TLR) 2 and TLR4 expression in monocytes from patients with type 1 diabetes: further evidence of a proinflammatory state. J. Clin. Endocrinol. Metab., 2008, no. 93, pp. 578-583.

7. Dong C. TH17 cells in development: an updated view of their molecular identity and genetic programming. Nat. Rev. Immunol., 2008, no. 8, pp. 337-348.

8. Faustman D.L. TNF, TNF inducers, and TNFR2 agonists: A new path to type 1 diabetes treatment. Diabetes Metab. Res. Rev., 2018, Vol. 34, no. 1.

9. Flaherty S., Reynolds J.M. TLR function in murine CD4(+) T lymphocytes and their role in inflammation. Methods Mol Biol., 2016, no. 1390, pp. 215-227.

10. Fulford T.S., Ellis D., Gerondakis S. Understanding the roles of the NF-κB pathway in regulatory T cell development, differentiation and function. Prog. Mol. Biol. Transl. Sci., 2015, no. 136, pp. 57-67.

11. Hase K., Kawano K., Nochi T., Pontes G.S., Fukuda S., Ebisawa M., Kadokura K., Tobe T., Fujimura Y., Kawano S., Yabashi A., Waguri S., Nakato G., Kimura S., Murakami T., Iimura M., Hamura K., Fukuoka S., Lowe A.W., Itoh K., Kiyono H., Ohno H. Uptake through glycoprotein 2 of FimH1 bacteria by M cells initiates mucosal immune response. Nature, 2009, Vol. 462, no. 7270, pp. 226-230.

12. Imanishi T., Hara H., Suzuki S., Suzuki N., Akira S., Saito T. Cutting edge: TLR2 directly triggers Th1 effector functions. J. Immunol., 2007, no. 178, pp. 6715-6719.

13. Jialal I., Yun J.M., Bremer A., Devaraj S. Demonstration of increased TLR2 and TLR4 Expression in monocytes of type 1 diabetic patients with microvascular complications. Metabolism, 2011, Vol. 60, no. 2, pp. 256-259.

14. Kanaya T., Hase K., Takahashi D., Fukuda S., Hoshino K., Sasaki I., Hemmi H., Knoop K.A., Kumar N., Sato M., Katsuno T., Yokosuka O., Toyooka K., Nakai K., Sakamoto A., Kitahara Y., Jinnohara T., McSorley S.J., Kaisho T., Williams I.R., Ohno H. The Ets transcription factor Spi-B is essential for the differentiation of intestinal microfold cells. Nat. Immunol., 2012, Vol. 13, no. 8, pp. 729-736.

15. Knoop K.A., Kumar N., Butler B.R., Sakthivel S.K., Taylor R.T., Nochi T., Akiba H., Yagita H., Kiyono H., Williams I.R. RANKL is necessary and sufficient to initiate development of antigen-sampling M cells in the intestinal epithelium. J. Immunol., 2009, Vol. 183, no. 9, pp. 5738-5747.

16. Koulmanda M., Bhasin M., Awdeh Z., Qipo A., Fan Z., Hanidziar D., Putheti P., Shi H., Csizuadia E., Libermann T.A., Strom T.B. The role of TNF-α in mice with type 1and 2diabetes. PLoS ONE, 2012, Vol. 7, no. 5, pp. 332-354.

17. Liang L., Beshay E., Prud’homme G.J. The phosphodiesterase inhibitors pentoxifylline and rolipram prevent diabetes in NOD mice. Diabetes, 1998, Vol. 47, no. 4, pp. 570-575.

18. Maloy K.J., Powrie F. Intestinal homeostasis and its breakdown in inflammatory bowel disease. Nature, 2011, no. 474, pp. 298-306.

19. Nakamura Y., Kimura S., Hase K. M cell-dependent antigen uptake on follicle-associated epithelium for mucosal immune surveillance. Inflamm. Regen., 2018, no. 38, pp. 1-5.

20. Needell J.C., Zipris D. The Role of the intestinal microbiome in type 1 diabetes pathogenesis. Curr. Diab. Rep., 2016, Vol. 16, no. 10, pp. 8-9.

21. Ohno H. Intestinal M cells. J. Biochem., 2016, Vol. 159, no. 2, pp. 151-160.

22. Opazo M.C., Ortega-Rocha E.M., Coronado-Arrázola I., Bonifaz L.C., Boudin H., Neunlist M., Bueno S.M., Kalergis A.M., Riedel C.A.. Intestinal microbiota influences non-intestinal related autoimmune diseases. Front. Microbiol., 2018, Vol. 9, 432. doi: 10.3389/fmicb.2018.00432.

23. Qiao Y.C., Chen Y.L., Pan Y.H., Tian F., Xu Y., Zhang X.X., Zhao H.L. The change of serum tumor necrosis factor alpha in patients with type 1 diabetes mellitus: A systematic review and meta-analysis. PLoS ONE, 2017, Vol. 12, no. 4, e0176157. doi: 10.1371/journal.pone.0176157.

24. Ramakrishnan P., Yui M.A., Tomalka J.A., Majumdar D., Parameswaran R., Baltimore D. Deficiency of nuclear factor-κB c-Rel accelerates the development of autoimmune diabetes in NOD mice. Diabetes, 2016, Vol. 65, no. 8, pp. 2367-2379.

25. Sato S., Kaneto S., Shibata N., Takahashi Y., Okura H., Yuki Y., Kunisawa J., Kiyono H. Transcription factor Spi-B-dependent and -independent pathways for the development of Peyer’s patch M cells. Mucosal Immunol., 2013, Vol. 6, no. 4, pp. 838-846.

26. Taylor R.T., Patel S.R., Lin E., Butler B.R., Lake J.G., Newberry R.D., Williams I.R. Lymphotoxin-independent expression of TNF-related activation-induced cytokine by stromal cells in cryptopatches, isolated lymphoid follicles, and Peyer’s patches. J. Immunol., 2007, Vol. 178, no. 9, pp. 5659-5667.

27. Vaarala O. Human intestinal microbiota and type 1 diabetes. Curr. Diab. Rep., 2013, Vol. 13, no. 5, pp. 601-607.

28. Visser J., Groen H., Klatter F., Rozing J. Timing of pentoxifylline treatment determines its protective effect on diabetes development in the Bio Breeding rat. Eur. J. Pharmacol., 2002, Vol. 445, no. 1-2, pp. 133-140.

29. Wood M.B., Rios D., Williams I.R.TNF-α augments RANKL-dependent intestinal M cell differentiation in enteroid cultures. Am. J. Physiol. Cell Physiol., 2016, Vol. 311, no. 3, pp. 498-507.

30. Zanin-Zhorov A., Tal-Lapidot G., Cahalon L., Cohen-Sfady M., Pevsner-Fischer M., Lider O., Cohen I.R. Cutting edge: T cells respond to lipopolysaccharide innately via TLR4 signaling. J. Immunol., 2007, Vol. 179, no. 1, pp. 41-44.

31. Zhang H., Bi J., Yi H., Fan T., Ruan Q., Cai L., Chen Y.H., Wan X. Silencing c-Rel in macrophages dampens Th1 and Th17 immune responses and alleviates experimental autoimmune encephalomyelitis in mice. Immunol. Cell Biol., 2017, Vol. 95, no. 7, pp. 593-600.