Preview

Медицинская иммунология

Расширенный поиск

Разработка иммуноферментного метода контроля качества вакцины на основе гибридного рекомбинантного белка P. aeruginosa

https://doi.org/10.15789/1563-0625-DOE-1906

Полный текст:

Аннотация

Гибридный рекомбинантный белок  OprF-aTox-OprI, содержащий в своeм  составе аминокислотные последовательности трех наиболее значимых антигенов P. aeruginosа (мембранных белков OprF, OprI  и анатоксина aTox),  был включен в состав  вакцины против синегнойной инфекции. Контроль качества гибридного рекомбинантного белка  и вакцины на его основе предполагает определение его подлинности и полноты сорбции препарата на гидроксиде алюминия.

Цель исследования – разработка иммуноферментного метода  контроля качества вакцинного препарата на основе гибридного рекомбинантного белка  P. aeruginosа.

Гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела, специфичные к слитому рекомбинантному  белку, были  получены путем  слияния злокачественной линии миеломы мыши и  иммунных спленоцитов мышей, вакцинированных отдельными рекомбинантными белками синегнойной палочки. Для наработки антител в препаративных количествах гибридные клетки культивировали in vivo в мышах линии BALB/c. Супернатанты клеточных культур и асцитные жидкости хроматографически очищали на иммунном сорбенте. Конъюгирование антител с пероксидазой хрена проводили согласно методу Nakane P.K.  Гибридный рекомбинантный белок  OprF-aTox-OprI выявляли в твердофазном иммуноферментном анализе с использованием полученной панели моноклональных антител и конъюгатов  моноклональных антител с пероксидазой корня хрена,  специфичных к различным эпитопам белка.  В качестве калибровочных стандартов для построения калибровочного графика использовали разведения, содержащие от 78 нг/мл до 5000 нг/мл рекомбинантного белка  OprF-aTox-OprI.

Для детекции OprF-aTox-OprI апробированы 55 вариантов пар моноклональных антител, в 11 случаях показана способность выявлять рекомбинантный белок.  Критерием отбора  наиболее чувствительных и специфичных вариантов ИФА  служил  предел  количественного обнаружения. Для всех 11 вариантов теста  посчитан предел  количественного обнаружения. В результате проведенных исследований были  выбраны два варианта иммуноферментного анализа для контроля качества гибридного рекомбинантного белка, обладающие наибольшей чувствительностью. Первый вариант включал в себя  пару  моноклональных антител, специфичных к эпитопам OprF  и OprI, второй вариант – к эпитопам aTox и OprI.  Пределы количественного обнаружения составили 2,9 и 13,6 нг/мл (0,0058  и 0,027% от предполагаемого содержания антигена в вакцине) для первого и второго вариантов ИФА.

Отработаны два  варианта ИФА  для  выявления гибридного рекомбинантного белка  OprF-aToxOprI. Первый вариант позволяет определить количество белка и оценить полноту его сорбции на геле гидроокиси алюминия. Для подтверждения подлинности белка целесообразно применять оба метода, поскольку они позволяют доказать наличие всех трех антигенов (OprF, aTox и OprI), присутствующих в слитом белке.

Об авторах

А. В. Солдатенкова
ФГБНУ Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток имени И.И. Мечникова
Россия

Солдатенкова Алёна Владимировна – кандидат биологических наук,  старший научный сотрудник лаборатории протективных антигенов.

105064, Москва, Малый Казенный пер., 5а. Тел.: 8 (495) 916-25-87



А. М. Кудряшова
ФГБНУ Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток имени И.И. Мечникова
Россия

Кудряшова Александра Михайловна – научный сотрудник лаборатории медицинской  биотехнологии.

Москва


Н. Ф. Гаврилова
ФГБНУ Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток имени И.И. Мечникова
Россия

Гаврилова Наталья Федоровна – кандидат химических наук, старший научный сотрудник лаборатории клеточных гибридов.

Москва



И. В. Яковлева
ФГБНУ Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток имени И.И. Мечникова
Россия

Яковлева Ирина Владимировна – кандидат биологических наук,  ведущий научный сотрудник лаборатории клеточных гибридов.

Москва



О. В. Борисова
ФГБНУ Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток имени И.И. Мечникова
Россия

Борисова Ольга Васильевна – кандидат химических наук, заведующая  лабораторией медицинской  биотехнологии.

Москва


В. В. Свиридов
ФГБНУ Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток имени И.И. Мечникова
Россия

Свиридов Валерий Васильевич – кандидат медицинских наук, заведующий  лабораторией клеточных гибридов.

Москва



Н. А. Михайлова
ФГБНУ Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток имени И.И. Мечникова
Россия

Михайлова Наталья Александровна – доктор медицинских наук, профессор, заведующая лабораторией протективных антигенов.

Москва


Список литературы

1. Благовидов Д.А., Костинов М.П., Симонова О.И., Шмитько А.Д., Буркина Н.И., Шахназарян М.К. Переносимость вакцины против P. aeruginosa у детей с муковисцидозом и врожденными пороками развития легких // Эпидемиология и вакцинопрофилактика, 2016. Т. 15, № 2 (87), С. 55-66.

2. Калошин А.А., Леонова Е.И., Солдатенкова А.В., Михайлова Н.А. Исследование протективных свойств рекомбинантного комплекса белка F наружной мембраны и анатоксина Pseudomonas aeruginosa // Вестник Российской академии медицинских наук, 2016, Т. 71, № 1. С. 5-10.

3. Лазарева А.В., Чеботарь И.В., Крыжановская О.А., Чеботарь В.И., Маянский Н.А. Pseudomonas aeruginosa: патогенность, патогенез и патология // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия, 2015. Т. 17, № 3. С. 170-186.

4. Михайлова Н.А., Зимина Е.М., Солдатенкова А.В., Калошин А.А. Разработка вакцины на основе рекомбинантных антигенов синегнойной палочки // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии, 2019. № 1. С. 74-80.

5. Патент РФ № 2677790 С1, 2017.09.22. – Калошин А.А., Зимина Е.М., Михайлова Н.А. Рекомбинантная плазмидная ДНК pPA-OPRF-ATOX-OPRI, кодирующая синтез гибридного рекомбинантного белка, включающего аминокислотные последовательности белков F и I наружной мембраны и атоксического варианта экзотоксина А Pseudomonas aeruginosa, штамм Escherichia coli PA-OPRF-ATOX-OPRI – продуцент гибридного рекомбинантного белка, и способ получения указанного белка.

6. Солдатенкова А.В., Зимина Е.М., Кудряшова А.М., Гаврилова Н.Ф., Яковлева И.В., Борисова О.В., Свиридов В.В., Михайлова Н.А. Разработка иммуноферментных методов оценки контроля качества рекомбинантной вакцины синегнойной // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии, 2019. № 1. С. 95-100.

7. Doring G., Meisner C., Stern М. A double-blind randomized placebo-controlled phase III study of a Pseudomonas aeruginosa flagella vaccine in cystic fibrosis patients. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2007, Vol. 104, no. 26, pp. 11020-11025.

8. Farajnia S., Peerayeh S.N., Tanomand A., Majidi J., Goudarzi G., Naghili B., Rahbarnia L. Protective efficacy of recombinant exotoxin A – flagellin fusion protein against Pseudomonas aeruginosa infection. Can. J. Microbiol., 2015, Vol. 61, no. 1, pp. 60-64.

9. Zuercher A.W., Imboden M.A., Jampen S., Bosse D., Ulrich M., Chtioui H., Lauterburg B.H., Lang A.B. Cellular immunity in healthy volunteers treated with an octavalent conjugate Pseudomonas aeruginosa vaccine. Clin. Exp. Immunol., 2006, Vol. 143, no. 1, pp. 132-138.


Дополнительные файлы

1. Метаданные
Тема
Тип Исследовательские инструменты
Скачать (15KB)    
Метаданные
2. Титульный лист
Тема
Тип Исследовательские инструменты
Скачать (17KB)    
Метаданные
3. Резюме
Тема
Тип Исследовательские инструменты
Скачать (24KB)    
Метаданные
4. Рисунок 1. Калибровочный график зависимости оптической плотности от концентрации OprF-aTox-OprI (нг/мл) с использованием пары МкАт №5 к OprF - МкАт № 2 к OprI, конъюгированных с пероксидазой корня хрена.
Тема
Тип Исследовательские инструменты
Скачать (16KB)    
Метаданные
5. Рисунок 2. Калибровочный график зависимости оптической плотности от концентрации OprF-aTox-OprI (нг/мл) в тесте с использованием пары МкАт №28 к анатоксину - МкАт №2 к OprI, конъюгированных с пероксидазой корня хрена.
Тема
Тип Исследовательские инструменты
Скачать (16KB)    
Метаданные
6. Названия рисунков
Тема
Тип Исследовательские инструменты
Скачать (13KB)    
Метаданные
7. Таблица 1. Пределы количественного обнаружения для различных вариантов тестов
Тема
Тип Исследовательские инструменты
Скачать (14KB)    
Метаданные
8. Список литературы
Тема
Тип Исследовательские инструменты
Скачать (27KB)    
Метаданные
9. подписи авторов
Тема
Тип Исследовательские инструменты
Метаданные

Для цитирования:


Солдатенкова А.В., Кудряшова А.М., Гаврилова Н.Ф., Яковлева И.В., Борисова О.В., Свиридов В.В., Михайлова Н.А. Разработка иммуноферментного метода контроля качества вакцины на основе гибридного рекомбинантного белка P. aeruginosa. Медицинская иммунология. 2020;22(4):805-810. https://doi.org/10.15789/1563-0625-DOE-1906

For citation:


Soldatenkova A.V., Kudryashova A.M., Gavrilova N.F., Yakovleva I.V., Borisova O.V., Sviridov V.V., Mikhailova N.A. Development of ELISA test for the quality control of Pseudomonas aeruginosa recombinant vaccine based on the hybrid recombinant protein. Medical Immunology (Russia). 2020;22(4):805-810. (In Russ.) https://doi.org/10.15789/1563-0625-DOE-1906

Просмотров: 206


Creative Commons License
Контент доступен под лицензией Creative Commons Attribution 4.0 License.


ISSN 1563-0625 (Print)
ISSN 2313-741X (Online)