Сравнение эффективности мРНК и плазмидных векторов при трансфекции лимфоцитов периферической крови

Адоптивная CAR-T-клеточная терапия – инновационный подход в онкологии, который использует полученные от пациента генетически модифицированные Т-клетки в качестве терапевтического инструмента для борьбы с раком. Использование ДНК-плазмид и транскрибируемой in vitro (IVT) мРНК в качестве векторов для получения CAR-T-лимфоцитов имеет ряд преимуществ по сравнению с вирусными векторами, такими как: отсутствие модификации генома клеток, высокая эффективность трансфекции, быстрота и потенциально более низкая стоимость получения конечного продукта. В работе исследована эффективность трансфекции (в терминах жизнеспособности клеток и экспрессии целевого белка) мононуклеарных клеток периферической крови и клеток перевиваемой культуры (эмбриональные клетки почки человека, HEK293) методом электропорации, используя модельные ДНК-плазмиду (pmaxGFP) и IVT-мРНК (мРНК-GFP), кодирующих зеленый флуоресцентный белок (green fluorescent protein, GFP). Проведен подбор оптимального режима трансфекции. Показано, что, хотя мРНК-GFP дает сравнимое количество клеток, экспрессирующих GFP, жизнеспособность клеток и, соответственно, эффективность трансфекции в целом при использовании мРНК-GFP как вектора значительно выше. При этом сравнение уровня экспрессии клеток трансфецированных двумя методами показывает, что использование мРНК дает более однородные показатели, тогда как при использование плазмидного вектора уровень экспрессии отличается на несколько порядков. Было проведено сравнение изменение уровня экспрессии в течении 7 дней после трансфекции. Показано, что доля GFP-позитивных клеток убывает со временем и не зависит от способа трансфекции, при этом оценка доли жизнеспособных клеток показала, что трансфекция плазмидой приводит к снижению доли жизнеспособных клеток через 7 суток до 30%, в то время как использование мРНК практически не влияет на жизнеспособность (количество живых клеток через 7 суток практически не отличается от контроля). Полученные результаты указывают, что использование IVT-мРНК может оказаться более предпочтительным средством при производстве CAR-T-продуктов методом электропорации.

1. Боженко В.К., Шишкин А.М., Шкопоров А.Н., Я.Ю. Киселева, Кулинич Т.М., Большакова О.Б., Кудинова Е.А., Солодкий В.А. Исследование подавления роста опухоли, экспрессирующей раково-эмбриональный антиген, новым высокотехнологичным препаратом карплазмин (cAR-T-терапия) у мышей линии Balb/c nude // Успехи молекулярной онкологии, 2023. Т. 10, № 1. С. 79-86.

2. Bonifant C.L., Jackson H.J., Brentjens R.J., Curran K.J. Toxicity and management in CAR T-cell therapy. Mol. Ther. Oncolytics, 2016, Vol. 3, 16011. doi: 10.1038/mto.2016.11.

3. Bozza M., De Roia A., Correia M.P., Berger A., Tuch A., Schmidt A., Zörnig I., Jäger D., Schmidt P., Harbottle R.P. A nonviral, nonintegrating DNA nanovector platform for the safe, rapid, and persistent manufacture of recombinant T cells. Sci. Adv., 2021, Vol. 7, no. 16, eabf1333. doi: 10.1126/sciadv.abf1333.

4. Bulcha J.T., Wang Y., Ma H., Tai P.W.L., Gao G. Viral vector platforms within the gene therapy landscape. Sig. Transduct Target Ther., 2021, Vol. 6, no. 1, 53. doi: 10.1038/s41392-021-00487-6.

5. Chen W, Zhu Y, He J, Sun X. Path towards mRNA delivery for cancer immunotherapy from bench to bedside. Theranostics, 2024, Vol. 14, no. 1, pp. 96-115.

6. Chen Y.J., Abila B., Mostafa Kamel Y. CAR-T: What Is Next? Cancers, 2023, Vol. 15, no. 3, 663. doi: 10.3390/cancers15030663.

7. Cooper L.J., Ausubel L., Gutierrez M., Stephan S., Shakeley R., Olivares S., Serrano L.M., Burton L., Jensen M.C., Forman S.J., DiGiusto D.L. Manufacturing of gene-modified cytotoxic T lymphocytes for autologous cellular therapy for lymphoma. Cytotherapy, 2006, Vol. 8, no. 2, pp. 105-117.

8. Corish P., Tyler-Smith C. Attenuation of green fluorescent protein half-life in mammalian cells. Protein Eng., 1999, Vol. 12, no. 12, pp. 1035-1040.

9. Garfall A.L., Cohen A.D., Susanibar-Adaniya S.P., Hwang W.T., Vogl D.T., Waxman A.J., Lacey S.F., Gonzalez V.E., Fraietta J.A., Gupta M., Kulikovskaya I., Tian L., Chen F., Koterba N., Bartoszek R.L., Patchin M., Xu R., Plesa G., Siegel D.L., Brennan A., Nelson A.M., Ferthio R., Cosey A., Shea K.M., Leskowitz R., Four M., Wilson W.V., Miao F., Lancaster E., Carreno B.M., Linette G.P., Hexner E.O., Young R.M., Bu D., Mansfield K.G., Brogdon J.L., June C.H., Milone M.C., Stadtmauer E.A. Anti-BCMA/CD19 CAR T cells with early immunomodulatory maintenance for multiple myeloma responding to initial or later-line therapy. Blood Cancer Discov., 2023, Vol. 4, no. 2, pp. 118-133.

10. Ghilardi G., Fraietta J.A., Gerson J.N., van Deerlin V.M., Morrissette J.J.D., Caponetti G.C., Paruzzo L., Harris J.C., Chong E.A., Susanibar Adaniya S.P., Svoboda J., Nasta S.D., Ugwuanyi O.H., Landsburg D.J., Fardella E., Waxman A.J., Chong E.R., Patel V., Pajarillo R., Kulikovskaya I., Lieberman D.B., Cohen A.D., Levine B.L., Stadtmauer E.A., Frey N.V., Vogl D.T., Hexner E.O., Barta S.K., Porter D.L., Garfall A.L., Schuster S.J., June C.H., Ruella M. T cell lymphoma and secondary primary malignancy risk after commercial CAR T cell therapy. Nat Med., 2024, Vol. 30, no. 4, pp. 984-989.

11. Kenoosh H.A., Pallathadka H., Hjazi A., Al-Dhalimy A.M.B., Zearah S.A., Ghildiyal P., Al-Mashhadani Z.I., Mustafa Y.F., Hizam M.M., Elawady A. Recent advances in mRNA-based vaccine for cancer therapy; bench to bedside. Cell Biochem. Funct., 2024, Vol. 42, no. 2, e3954. doi: 10.1002/cbf.3954.

12. Koppu V., Poloju D., Puvvala B., Madineni K., Balaji S., Sheela C.M.P., Manchikanti S.S.C., Moon S.M. Current Perspectives and Future Prospects of mRNA Vaccines against Viral Diseases: A Brief Review. Int. J. Mol. Cell. Med., 2022, Vol. 11, no. 3, pp. 260-272.

13. Krug C., Wiesinger M., Abken H., Schuler-Thurner B., Schuler G., Dörrie J., Schaft N. A GMP-compliant protocol to expand and transfect cancer patient T cells with mRNA encoding a tumor-specific chimeric antigen receptor. Cancer Immunol. Immunother., 2014, Vol. 63, no. 10, pp. 999-1008.

14. Labbé R.P., Vessillier S., Rafiq Q.A. Lentiviral vectors for T cell engineering: clinical applications, bioprocessing and future perspectives. Viruses, 2021, Vol. 13, no. 8, 1528. doi: 10.3390/v13081528.

15. Liu C., Shi Q., Huang X., Koo S., Kong N., Tao W. mRNA-based cancer therapeutics. Nat. Rev. Cancer, 2023, Vol. 23, no. 8, pp. 526-543.

16. Qin S., Tang X., Chen Y., Chen K., Fan N., Xiao W., Zheng Q., Li G., Teng Y., Wu M., Song X. mRNA-based therapeutics: powerful and versatile tools to combat diseases. Signal Transduct. Target Ther., 2022, Vol. 7, no. 1, 166. doi: 10.1038/s41392-022-01007-w.

17. Sayadmanesh A., Yekehfallah V., Valizadeh A., Abedelahi A., Shafaei H., Shanehbandi D., Basiri M., Baradaran . Strategies for modifying the chimeric antigen receptor (CAR) to improve safety and reduce toxicity in CAR T cell therapy for cancer. Int. Immunopharmacol., 2023, Vol. 125, Pt A, 111093. doi: 10.1016/j.intimp.2023.111093.

18. Wang H., Tang L., Kong Y., Liu W., Zhu X., You Y. Strategies for reducing toxicity and enhancing efficacy of chimeric antigen receptor T cell therapy in hematological malignancies. Int. J. Mol. Sci., 2023, Vol. 24, no. 11, 9115. doi: 10.3390/ijms24119115.

19. Zhang Z., Qiu S., Zhang X., Chen W. Optimized DNA electroporation for primary human T cell engineering. BMC Biotechnol., 2018, Vol. 18, no. 1, 4. doi: 10.1186/s12896-018-0419-0.