Интраназальная иммунизация рекомбинантным белком на основе М2е-пептида и фрагмента второй субъединицы гемагглютинина вирусов гриппа А индуцирует кросс-протективный гуморальный и Т-клеточный ответ у мышей

Создание вакцин с широким спектром защиты является одной из приоритетных задач в области профилактики гриппа. В последнее время интерес исследователей вызывают консервативные фрагменты белков вируса гриппа (M1, M2, NP, вторая субъединица гемагглютинина HA2) как объект разработки рекомбинантных вакцин широкого спектра действия. Сложность в разработке вакцин на основе таких фрагментов заключается в их низкой иммуногенности. Однако присоединение слабоиммуногенных антигенов к белку-носителю позволяет значительно усилить их иммуноген-ность. Был разработан кандидатный вакцинный белок Flg-HA2-2-4M2e, содержащий два высококонсервативных вирусных антигена (эктодомен белка M2 — М2е и участок 76-130 второй субъединицы НА2), слитых с белком-носителем флагеллином. Флагеллин — белок жгутиков бактерий, является естественным лигандом Toll-подобного рецептора 5 (TLR-5) и обладает сильной адъювантной активностью при различных способах введения. Цель настоящего исследования состояла в оценке формирования гуморального и Т-клеточного иммунного ответа и широты протективного действия кандидат-ного вакцинного белка Flg-HA2-2-4M2e при введении мышам. Мышей иммунизировали трехкратно интраназально с двухнедельными интервалами. Через две недели после последней иммунизации животных заражали летальной дозой (5 LD₅₀) вирусов, относящихся к обеим филогенетическим группам (A/California/07/09 (H1N1)pdm09 или A/Shanghai/2/2013 (H7N9)). Полученные результаты показали формирование выраженного М2е-специфического гуморального ответа (сывороточных IgG и IgA) у иммунизированных мышей. Иммунизация приводила также к формированию M2e- и вирус-специ-фических CD4⁺ и CDS⁺T-клеток в легких, которые продуцировали TNFα и IFNγ. Выявлено формирование антиген-специфических эффекторных и центральных Т-клеток памяти в легких мышей опытной группы. Формирование кросс-протективного защитного иммунитета у иммунизированных мышей было продемонстрировано на модели летальной гриппозной инфекции. Опытные животные были практически полностью защищены (90-100% выживаемость) от высокой дозы пандемического вируса A/H1N1pdm09 и высокопатогенного вируса гриппа птиц A/H7N9. Второй задачей была оценка иммунного ответа на сублетальную инфекцию вирусом гриппа у иммунизированных животных. Мыши контрольной и опытной групп были инфицированы дозой MID100 вируса гриппа А/Aichi/2/68 (H3N2). Было показано, что у иммунизированных мышей, по сравнению с контрольными, в ответ на сублетальное инфицирование изменился профиль иммунного ответа иммуноглобулинами — в 10 раз увеличилась доля IgG2a, более оптимальных в защите от инфекции. Полученные результаты показали, что рекомбинантный белок Flg-HA2-2-4M2e является перспективным кандидатом для разработки универсальной вакцины нового поколения, формирующий протективный гуморальный и Т-клеточный ответ на консервативные вирусные эпитопы и защищающий от вирусов гриппа А обеих филогенетических групп.

1. Altenburg A.F., Rimmelzwaan G.F., de Vries R.D. Virus-specific T cells as correlate of (cross-) protective immunity against influenza. Vaccine, 2015, Vol. 33, pp. 500-506.

2. Ameghi A. Protective immunity against homologous and heterologous influenza virus lethal challenge by immunization with new recombinant chimeric HA2-M2e fusion protein in balb/c mice. Viral Immunol., 2016, Vol. 29, pp. 228-234.

3. Bates J.T. Mucosal adjuvant activity of flagellin in aged mice. Mech. Ageing Dev., 2008, Vol. 129, pp. 271-281.

4. Bessa J., Schmitz N., Hinton H.J. Efficient induction of mucosal and systemic immune responses by viruslike particles administered intranasally: implications for vaccine design. Eur. J. Immunol., 2008, Vol. 38, no. 1, pp. 114-126.

5. Bommakanti G. Design of an HA2-based Escherichia coli expressed influenza immunogen that protects mice from pathogenic challenge. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 2010, Vol. 107, pp. 13701-13706.

6. Cho K.J., Schepens B., Seok J.H., Kim S., Roose K., Lee J.H. Structure of the extracellular domain of matrix protein 2 of influenza A virus in complex with a protective monoclonal antibody. J. Virol., 2015 Vol. 89, pp. 3700-3711.

7. Cunningham A.F., Khan M., Ball J., Toellner K.M., Serre K., Mohr E. Responses to the soluble flagellar protein FliC are Th2, while those to FliC on Salmonella are Th1. Eur. J. Immunol., 2004, Vol. 34, pp. 2986-2995.

8. Delaney K.N., Phipps J.P., Johnson J.B., Mizel S.B. A recombinant flagellin-poxvirus fusion protein vaccine elicits complement-dependent protection against respiratory challenge with vaccinia virus in mice. Viral Immunol., 2010, Vol. 23, pp. 201-210.

9. Deng L., Kim J.R., Chang T.Z., Zhang H., Mohan T., Champion J.A., Wang B-Z. Protein nanoparticle vaccine based on flagellin carrier fused to influenza conserved epitopes confers full protection against influenza a virus challenge. Virology, 2017, Vol. 509, pp. 82-89.

10. Denis J., Acosta-Ramirez E., Zhao Y. Development of a universal influenza A vaccine based on the M2e peptide fused to the papaya mosaic virus (PapMV) vaccine platform. Vaccine, 2008, Vol. 26, no. 27-28, pp. 3395-3403.

11. Ekiert D.C. A highly conserved neutralizing epitope on group 2 influenza A viruses. Science, 2011, Vol. 333, pp. 843-850.

12. el Bakkouri K., Descamps F., de Filette M., Smet A., Festjens E., Birkett A. Universal vaccine based on ectodomain of matrix protein 2 of influenza A: Fc receptors and alveolar macrophages mediate protection. J. Immunol., 2011, Vol. 186, pp. 1022-1031.

13. Eliasson D.G., Omokanye A., SchoFn K. M2e tetramer-specific memory CD4 T cells are broadly protective against influenza infection. Mucosal Immunol., 2017, Vol. 11, pp. 273-289.

14. Feng J. Influenza A virus infection engenders a poor antibody response against the ectodomain of matrix protein 2. Virol. J., 2006, Vol. 3, p. 102.

15. Gong X. Conserved stem fragment from H3 influenza hemagglutinin elicits cross-clade neutralizing antibodies through stalk-targeted blocking of conformational change during membrane fusion. Immunol. Lett., 2016, Vol. 172, pp. 11-20.

16. Guo Y., He L., Song N., Li P., Sun S., Zhao G., Tai W, Jiang S., Du L., Zhou Y. Highly conserved M2e and hemagglutinin epitope-based recombinant proteins induce protection against influenza virus infection. Microbes Infect, 2017, Vol. 19, pp. 641-647.

17. Hashimoto Y., Moki T., Takizawa T., Shiratsuchi A., Nakanishi Y. Evidence for phagocytosis of influenza virus-infected, apoptotic cells by neutrophils and macrophages in mice. J. Immunol., 2007, Vol. 178, pp. 2448-2457.

18. Hazenbos W.L., Gessner J.E., Hofhuis F.M. Impaired IgG-dependent anaphylaxis and Arthus reaction in Fc gamma RIII (CD16) deficient mice. Immunity, 1996, Vol. 5, pp. 181-188.

19. Hillaire M.L., Osterhaus A.D., Rimmelzwaan G.F. Induction of virus-specific cytotoxic T lymphocytes as a basis for the development of broadly protective influenza vaccines. J. Biomed. Biotechnol., 2011, Vol. 2011, 939860. doi: 10.1155/2011/939860.

20. Honko A.N. Flagellin is an effective adjuvant for immunization against lethal respiratory challenge with Yersinia pestis. Infect. Immun., 2006, Vol. 74, pp. 1113-1120.

21. Huleatt J.W. Potent immunogenicity and efficacy of a universal influenza vaccine candidate comprising a recombinant fusion protein linking influenza M2e to the TLR5 ligand flagellin. Vaccine, 2008, Vol. 26, pp. 201-214.

22. Ingrole R.S., Tao W, Tripathy J.N., Gill H.S. Synthesis and Immunogenicity assessment of elastin-like polypeptide-M2e construct as an influenza antigen. Nano LIFE, 2014, Vol. 4, no. 2, 1450004. doi: 10.1142/s1793984414500044.

23. Ionescu R.M., Przysiecki C.T., Liang X. Pharmaceutical and immunological evaluation of human papillomavirus viruslike particle as an antigen carrier. J. Pharm. Sci., 2006, Vol. 95, no. 1, pp. 70-79.

24. Jegerlehner A. Influenza A vaccine based on the extracellular domain of M2: weak protection mediated via antibody-dependent NK cell activity. J. Immunol., 2004, Vol. 172, pp. 5598-5605.

25. Khanna M. Protective immunity based on the conserved hemagglutinin stalk domain and its prospects for universal influenza vaccine development. BioMed. Res. Int., 2014, Vol. 2014, 546274. doi: 10.1155/2014/546274.

26. Kim M.-C. Virus-like particles containing multiple M2 extracellular domains confer improved crossprotection against various subtypes of influenza virus. Mol. Ther., 2013, Vol. 21, pp. 485-492.

27. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 1970, Vol. 227, pp. 680-685.

28. Liu G. Flagellin-HA vaccines protect ferrets and mice against H5N1 highly pathogenic avian influenza virus (HPAIV) infections. Vaccine, 2012, Vol. 30, pp. 6833-6838.

29. Liu W, Peng Z., Liu Z. High epitope density in a single recombinant protein molecule of the extracellular domain of influenza A virus M2 protein significantly enhances protective immunity. Vaccine, 2004, Vol. 23, no. 3, pp. 366-371.

30. Mozdzanovska K., Zharikova D., Cudic M., Otvos L., Gerhard W. Roles of adjuvant and route of vaccination in antibody response and protection engendered by a synthetic matrix protein 2-based influenza A virus vaccine in the mouse. Virol. J., 2007, Vol. 4, p. 118.

31. Neirynck S., Deroo T., Saelens X., Vanlandschoot P. A universal influenza A vaccine based on the extracellular domain of the M2 protein. Nat. Med., 1999, Vol. 5, no. 10, pp. 1157-1163.

32. Nimmerjahn F., Ravetch J.V. Divergent immunoglobulin G subclasses activity through selective Fc receptor binding. Science, 2005, Vol. 310, pp. 1510-1512.

33. Nimmerjahn F., Ravetch J.V Fc-gamma receptors: old friends and new family members. Immunity, 2006, Vol. 24, pp. 19-28.

34. Schotsaert M. Universal M2 ectodomain-based influenza A vaccines: preclinical and clinical developments. Expert. Rev. Vaccines., 2009, Vol. 8, pp. 499-508.

35. Slepushkin V.A., Katz J.M., Black R.A. Protection of mice against influenza A virus challenge by vaccination with baculovirus-expressed M2 protein. Vaccine, 1995, Vol. 13, no. 15, pp. 1399-1402.

36. Stepanova L.A. A fusion protein based on the second subunit of hemagglutinin of influenza A/H2N2 viruses provides cross immunity. Acta Naturae, 2016, Vol. 8, pp. 116-126.

37. Stepanova L.A. Protection against multiple influenza A virus strains induced by candidate recombinant vaccine based on heterologous M2e peptides linked to flagellin. PLoS ONE, 2015, Vol. 10, e0119520. doi: 10.1371/journal.pone.0119520.

38. Stepanova L.A., Mardanova E.S., Shuklina M.A. Flagellin-fused protein targeting M2e and HA2 induces potent humoral and T-cell responses and protects mice against various influenza viruses a subtypes. J. Biomed. Sci., 2018, Vol. 25, no. 1, p. 33.

39. Taylor D.N. Induction of a potent immune response in the elderly using the TLR-5 agonist, flagellin, with a recombinant hemagglutinin influenza-flagellin fusion vaccine (VAX125, STF2.HA1 SI). Vaccine, 2011, Vol. 29, pp. 4897-4902.

40. Tsybalova L.M. Development of a candidate influenza vaccine based on virus-like particles displaying influenza M2e peptide into the immunodominant region of hepatitis B core antigen: Broad protective efficacy of particles carrying four copies of M2e. Vaccine, 2015, Vol. 33, pp. 3398-3406.

41. Turley C.B. Safety and immunogenicity of a recombinant M2e-flagellin influenza vaccine (STF2.4xM2e) in healthy adults. Vaccine, 2011, Vol. 29, pp. 5145-5152.

42. Wang T.T. Broadly protective monoclonal antibodies against H3 influenza viruses following sequential immunization with different hemagglutinins. PloSPathog., 2010, Vol. 6, e1000796. doi: 10.1371/journal.ppat.1000796.

43. Wang T.T. Vaccination with a synthetic peptide from the influenza virus hemagglutinin provides protection against distinct viral subtypes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 2010, Vol. 107, pp. 18979-18984.

44. World Health Organization [Электронный ресурс]: сайт. Режим доступа: http://www.who.int/entity/ csr/don/26-october-2017-ah7n9-china/en. [World Health Organization [Electronic resource]. Access mode: www.who.int/entity/csr/don/26-october-2017-ah7n9-china/en.].

45. Wrammert J. Broadly cross-reactive antibodies dominate the human B cell response against 2009 pandemic H1N1 influenza virus infection. J. Exp. Med., 2011, Vol. 208, pp. 181-193.

46. Wu F., Huang J.H., Yuan X.Y. Characterization of immunity induced by M2e of influenza virus. Vaccine, 2007, Vol. 25, no. 52, pp. 8868-8873.

47. Zhang H., Wang L., Compans R.W., Wang B.Z. Universal influenza vaccines, a dream to be realized soon. Viruses, 2014, Vol. 6, pp. 1974-1991.

48. Zhou L., Ren R., Yang L., Bao C., Wu J., Wang D. Sudden increase in human infection with avian influenza A(H7N9) virus in China, Semptember-December 2016. Western Pac Surveill Response J., 2017, Vol. 8, pp. 6-14.