Preview

Медицинская иммунология

Расширенный поиск

РАЗРАБОТКА НАБОРА РЕАГЕНТОВ ДЛЯ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ МОЛЕКУЛ ДНК TREC И KREC В ЦЕЛЬНОЙ КРОВИ И СУХИХ ПЯТНАХ КРОВИ МЕТОДОМ МУЛЬТИПЛЕКСНОЙ ПЦР В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ

https://doi.org/10.15789/1563-0625-2015-5-467-478

Полный текст:

Аннотация

Первичные иммунодефициты (ПИД), тяжелый комбинированный иммунодефицит (ТКИН) и Х-сцепленная агаммаглобулинемия, характеризуются отсутствием функциональных Ти В-лимфоцитов соответственно. Без своевременной ранней диагностики и лечения дети с ПИД страдают от инфекционных заболеваний с тяжелым течением, что приводит к их инвалидизации или смерти.

Цель: разработать и апробировать на группе детей с верифицированными диагнозами ТКИН и Х-сцепленной агаммаглобулинемией простую, недорогую, высокопропускную методику на основе количественного определения молекул ДНК TREC и KREC с помощью ПЦР в режиме реального времени.

В настоящем исследовании мы разработали и валидировали метод проведения мультиплексной полимеразной цепной реакции в режиме «реального времени» для количественного анализа молекул ДНК TREC и KREC. Нами было показано, что в области концентраций от 109 коп/мл до 5 × 104 коп/мл для всех мишеней наблюдается линейный диапазон изменения Сt в зависимости от концентрации с коэффициентом корреляции R2 не хуже 0,98. Наименьшее количество копий, надежно детектиру емых в одной ПЦР реакции объемом 25 мкл, было: 10 для TREC, 5 для KREC и 5 для внутреннего контроля – локуса IL17RA. Нами определены референсные значения для количества TREC и KREC в цельной крови в зависимости от возраста в группе из 29 мальчиков и 27 девочек с нормальными иммунологическими параметрами. Были определены граничные значения для содержания TREC и KREC в сухих пятнах крови в зависимости от метода экстракции ДНК.

Предложенная методика показала 100% диагностическую чувствительность и специфичность на исследуемой выборке. Метод может быть предложен как скрининговый для диагностики ТКИН и Х-сцепленной агаммаглобулинемии как в цельной крови, так и в сухих пятнах крови. Требуется дальнейшая апробация методики на выборках большего объема. 

Об авторах

М. А. Гордукова
Детская городская клиническая больница № 9 им. Г.Н. Сперанского, Москва
Россия

Биолог клинической диагностической лаборатории.

Адрес для переписки: Гордукова Мария Александровна ГБУЗ «Детская городская клиническая больница № 9 им. Г.Н. Сперанского 123317, Россия, Москва, Шмитовский проезд, 29. Тел.: 8 (499) 256-21-62. Факс: 8 (499) 256-61-27. E-mail: ma.gordukova@dgkb-9.ru

 



И. П. Оскорбин
Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, Новосибирск; Новосибирский государственный исследовательский университет
Россия
Аспирант кафедры молекулярной биологии, Новосибирский государственный исследовательский университе


О. В. Мишукова
Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, Новосибирск
Россия
Младший научный сотрудник лаборатории фармакогеномики


С. Б. Зимин
Детская городская клиническая больница № 9 им. Г.Н. Сперанского, Москва
Россия
Заведующий отделением иммунопатологии


Н. В. Зиновьева
Детская городская клиническая больница № 9 им. Г.Н. Сперанского, Москва
Россия
Кандидат медицинских наук, заведующая отделением аллергологии и иммунологии


Н. В. Давыдова
Детская городская клиническая больница № 9 им. Г.Н. Сперанского, Москва
Россия
Кандидат медицинских наук, врач клинической диагностической лаборатории


А. С. Смирнова
Детская городская клиническая больница № 9 им. Г.Н. Сперанского, Москва
Россия
Врач клинической диагностической лаборатории


И. А. Никитина
Детская городская клиническая больница № 9 им. Г.Н. Сперанского, Москва
Россия
Заведующая учебной лабораторией кафедры факультетской педиатрии № 2 педиатрического факультета РНИМУ им. Пирогова на базе ГБУЗ «Детская городская клиническая больница № 9 им. Г.Н. Сперанского»


И. А. Корсунский
Детская городская клиническая больница № 9 им. Г.Н. Сперанского, Москва
Россия
Кандидат медицинских наук, заведующий московским городским центром детской иммунологии и аллергологии


М. Л. Филипенко
Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, Новосибирск; Новосибирский государственный исследовательский университет
Россия
Кандидат биологических наук, заведующий лабораторией фармакогеномики, Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН; заведующий лабораторией палеогенетики, Новосибирский государственный исследовательский университет


А. П. Продеус
Детская городская клиническая больница № 9 им. Г.Н. Сперанского, Москва
Россия
Доктор медицинских наук, профессор, заместитель главного врача по инфекционным болезням


Список литературы

1. Alt F.W., Oltz E.M., Young F., Gorman J., Taccioli G., Chen J. VDJ recombination. Immunology Today, 1992, Vol. 11, no. 8, pp. 306-214.

2. Blackwell T.K., Alt F.W. Mechanism and developmental program of immunoglobulin gene rearrangement in mammals. Annual Review of Genetics, 1989, Vol. 23, pp. 605-636.

3. Douek D.C., McFarland R.D., Keiser P.H., Gage E.A., Massey J.M., Haynes B.F., Polis M.A., Haase A.T., Feinberg M.B., Sullivan J.L., Jamieson B.D., Zack J.A., Picker L.J., Koup R.A. Changes in thymic function with age and during the treatment of HIV infection. Nature, 1998, Vol. 17, no. 39, pp. 690-695.

4. Tonegawa S. Somatic generation of antibody diversity. Nature, 1983, Vol. 302, pp. 575-581.

5. van der Burg M., Tümkaya T., Boerma M., de Bruin-Versteeg S., Langerak A.W., van Dongen J.J. Ordered recombination of immunoglobulin light chain genes occurs at the IGK locus but seems less strict at the IGL locus. Blood, 2001, Vol. 97, pp. 1001-1008.

6. van Zelm M.C., Szczepanski T., van der Burg M., van Dongen J.J. Replication history of B lymphocytes reveals homeostatic proliferation and extensive antigen-induced B cell expansion. The Journal of Experimental Medicine, 2007, Vol. 204, pp. 645-655.

7. Amariglio N., Lev A., Simon A., Rosenthal E., Spirer Z., Efrati O., Broides A., Rechavi G., Somech R. Molecular assessment of thymus capabilities in the evaluation of T-cell immunodeficiency. Pediatric Research, 2010, Vol. 67, no. 2, pp. 211-216.

8. Puck J.M., SCID Newborn Screening Working Group. Population-based newborn screening for severe combined immunodeficiency: steps toward implementation. Journal of Allergy and Clinical Immunology, 2007, Vol. 120, no. 4, pp. 760-768.

9. Roifman C.M., Somech R., Grunebaum E. Matched unrelated bone marrow transplant for T+ combined immunodeficiency. Bone Marrow Transplantation, 2008, Vol. 41, pp. 947-952.

10. Baker M.W., Grossman W.J., Laessig R.H., Hoffman G.L., Brokopp C.D., Kurtycz D.F., Cogley M.F., Litsheim T.J., Katcher M.L., Routes J.M. Development of a routine newborn screening protocol for severe combined immunodeficiency. Journal of Allergy and Clinical Immunology, 2009, Vol. 124, no. 3, pp. 522-527.

11. Sottini A., Ghidini C., Zanotti C., Chiarini M., Caimi L., Lanfranchi A., Moratto D., Porta F., Imberti L. Simultaneous quantification of recent thymic T-cell and bone marrow B-cell emigrants in patients with primary immunodeficiency undergone to stem cell transplantation. Clinical Immunology, 2010, Vol. 136, no 2, pp. 217-227.

12. Borte S., von Döbeln U., Fasth A., Wang N., Janzi M., Winiarski J., Sack U., Pan-Hammarström Q., Borte M., Hammarström L. Neonatal screening for severe primary immunodeficiency diseases using high-throughput triplex real-time PCR. Blood, 2012, Vol. 119, no 11, pp. 2552-2555.

13. Lang P.O., Govind S., Dramé M., Aspinall R. Comparison of manual and automated DNA purification for measuring TREC in dried blood spot (DBS) samples with qPCR. Journal of Immunological Methods, 2012, Vol. 384, no. 1-2, pp. 118-127.

14. Ou X., Zhao H., Sun H., Yang Z., Xie B., Shi Y., Wu X. Detection and quantification of the age-related sjTREC decline in human peripheral blood. International Journal of Legal Medicine, 2011, Vol. 125, pp. 603-608.

15. Ou X.L., Gao J., Wang H., Wang H.S., Lu H.L., Sun H.Y. Predicting human age with bloodstains by sjTREC quantification. PLoS ONE, 2012, Vol. 7, no. 8, p. e42412.


Для цитирования:


Гордукова М.А., Оскорбин И.П., Мишукова О.В., Зимин С.Б., Зиновьева Н.В., Давыдова Н.В., Смирнова А.С., Никитина И.А., Корсунский И.А., Филипенко М.Л., Продеус А.П. РАЗРАБОТКА НАБОРА РЕАГЕНТОВ ДЛЯ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ МОЛЕКУЛ ДНК TREC И KREC В ЦЕЛЬНОЙ КРОВИ И СУХИХ ПЯТНАХ КРОВИ МЕТОДОМ МУЛЬТИПЛЕКСНОЙ ПЦР В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ. Медицинская иммунология. 2015;17(5):467-478. https://doi.org/10.15789/1563-0625-2015-5-467-478

For citation:


Gordukova M.A., Oskorbin I.P., Mishukova O.V., Zimin S.B., Zinovieva N.V., Davydova N.V., Smirnova A.S., Nikitina I.A., Korsunsky I.A., Filipenko M.L., Prodeus A.P. DEVELOPMENT OF REAL-TIME MULTIPLEX PCR FOR THE QUANTITATIVE DETERMINATION OF TREC'S AND KREC'S IN WHOLE BLOOD AND IN DRIED BLOOD SPOTS. Medical Immunology (Russia). 2015;17(5):467-478. (In Russ.) https://doi.org/10.15789/1563-0625-2015-5-467-478

Просмотров: 1015


Creative Commons License
Контент доступен под лицензией Creative Commons Attribution 4.0 License.


ISSN 1563-0625 (Print)
ISSN 2313-741X (Online)