РАЗРАБОТКА НАБОРА РЕАГЕНТОВ ДЛЯ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ МОЛЕКУЛ ДНК TREC И KREC В ЦЕЛЬНОЙ КРОВИ И СУХИХ ПЯТНАХ КРОВИ МЕТОДОМ МУЛЬТИПЛЕКСНОЙ ПЦР В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ

Первичные иммунодефициты (ПИД), тяжелый комбинированный иммунодефицит (ТКИН) и Х-сцепленная агаммаглобулинемия, характеризуются отсутствием функциональных Ти В-лимфоцитов соответственно. Без своевременной ранней диагностики и лечения дети с ПИД страдают от инфекционных заболеваний с тяжелым течением, что приводит к их инвалидизации или смерти.

Цель: разработать и апробировать на группе детей с верифицированными диагнозами ТКИН и Х-сцепленной агаммаглобулинемией простую, недорогую, высокопропускную методику на основе количественного определения молекул ДНК TREC и KREC с помощью ПЦР в режиме реального времени.

В настоящем исследовании мы разработали и валидировали метод проведения мультиплексной полимеразной цепной реакции в режиме «реального времени» для количественного анализа молекул ДНК TREC и KREC. Нами было показано, что в области концентраций от 109 коп/мл до 5 × 104 коп/мл для всех мишеней наблюдается линейный диапазон изменения Сt в зависимости от концентрации с коэффициентом корреляции R2 не хуже 0,98. Наименьшее количество копий, надежно детектиру емых в одной ПЦР реакции объемом 25 мкл, было: 10 для TREC, 5 для KREC и 5 для внутреннего контроля – локуса IL17RA. Нами определены референсные значения для количества TREC и KREC в цельной крови в зависимости от возраста в группе из 29 мальчиков и 27 девочек с нормальными иммунологическими параметрами. Были определены граничные значения для содержания TREC и KREC в сухих пятнах крови в зависимости от метода экстракции ДНК.

Предложенная методика показала 100% диагностическую чувствительность и специфичность на исследуемой выборке. Метод может быть предложен как скрининговый для диагностики ТКИН и Х-сцепленной агаммаглобулинемии как в цельной крови, так и в сухих пятнах крови. Требуется дальнейшая апробация методики на выборках большего объема. 

1. Alt F.W., Oltz E.M., Young F., Gorman J., Taccioli G., Chen J. VDJ recombination. Immunology Today, 1992, Vol. 11, no. 8, pp. 306-214.

2. Blackwell T.K., Alt F.W. Mechanism and developmental program of immunoglobulin gene rearrangement in mammals. Annual Review of Genetics, 1989, Vol. 23, pp. 605-636.

3. Douek D.C., McFarland R.D., Keiser P.H., Gage E.A., Massey J.M., Haynes B.F., Polis M.A., Haase A.T., Feinberg M.B., Sullivan J.L., Jamieson B.D., Zack J.A., Picker L.J., Koup R.A. Changes in thymic function with age and during the treatment of HIV infection. Nature, 1998, Vol. 17, no. 39, pp. 690-695.

4. Tonegawa S. Somatic generation of antibody diversity. Nature, 1983, Vol. 302, pp. 575-581.

5. van der Burg M., Tümkaya T., Boerma M., de Bruin-Versteeg S., Langerak A.W., van Dongen J.J. Ordered recombination of immunoglobulin light chain genes occurs at the IGK locus but seems less strict at the IGL locus. Blood, 2001, Vol. 97, pp. 1001-1008.

6. van Zelm M.C., Szczepanski T., van der Burg M., van Dongen J.J. Replication history of B lymphocytes reveals homeostatic proliferation and extensive antigen-induced B cell expansion. The Journal of Experimental Medicine, 2007, Vol. 204, pp. 645-655.

7. Amariglio N., Lev A., Simon A., Rosenthal E., Spirer Z., Efrati O., Broides A., Rechavi G., Somech R. Molecular assessment of thymus capabilities in the evaluation of T-cell immunodeficiency. Pediatric Research, 2010, Vol. 67, no. 2, pp. 211-216.

8. Puck J.M., SCID Newborn Screening Working Group. Population-based newborn screening for severe combined immunodeficiency: steps toward implementation. Journal of Allergy and Clinical Immunology, 2007, Vol. 120, no. 4, pp. 760-768.

9. Roifman C.M., Somech R., Grunebaum E. Matched unrelated bone marrow transplant for T+ combined immunodeficiency. Bone Marrow Transplantation, 2008, Vol. 41, pp. 947-952.

10. Baker M.W., Grossman W.J., Laessig R.H., Hoffman G.L., Brokopp C.D., Kurtycz D.F., Cogley M.F., Litsheim T.J., Katcher M.L., Routes J.M. Development of a routine newborn screening protocol for severe combined immunodeficiency. Journal of Allergy and Clinical Immunology, 2009, Vol. 124, no. 3, pp. 522-527.

11. Sottini A., Ghidini C., Zanotti C., Chiarini M., Caimi L., Lanfranchi A., Moratto D., Porta F., Imberti L. Simultaneous quantification of recent thymic T-cell and bone marrow B-cell emigrants in patients with primary immunodeficiency undergone to stem cell transplantation. Clinical Immunology, 2010, Vol. 136, no 2, pp. 217-227.

12. Borte S., von Döbeln U., Fasth A., Wang N., Janzi M., Winiarski J., Sack U., Pan-Hammarström Q., Borte M., Hammarström L. Neonatal screening for severe primary immunodeficiency diseases using high-throughput triplex real-time PCR. Blood, 2012, Vol. 119, no 11, pp. 2552-2555.

13. Lang P.O., Govind S., Dramé M., Aspinall R. Comparison of manual and automated DNA purification for measuring TREC in dried blood spot (DBS) samples with qPCR. Journal of Immunological Methods, 2012, Vol. 384, no. 1-2, pp. 118-127.

14. Ou X., Zhao H., Sun H., Yang Z., Xie B., Shi Y., Wu X. Detection and quantification of the age-related sjTREC decline in human peripheral blood. International Journal of Legal Medicine, 2011, Vol. 125, pp. 603-608.

15. Ou X.L., Gao J., Wang H., Wang H.S., Lu H.L., Sun H.Y. Predicting human age with bloodstains by sjTREC quantification. PLoS ONE, 2012, Vol. 7, no. 8, p. e42412.