mimmunМедицинская иммунологияMedical Immunology (Russia)1563-06252313-741XSPb RAACI10.15789/1563-0625-2015-5-467-478mimmun-935Research ArticleИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫIMMUNOLOGICAL METHODSРАЗРАБОТКА НАБОРА РЕАГЕНТОВ ДЛЯ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ МОЛЕКУЛ ДНК TREC И KREC В ЦЕЛЬНОЙ КРОВИ И СУХИХ ПЯТНАХ КРОВИ МЕТОДОМ МУЛЬТИПЛЕКСНОЙ ПЦР В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИDEVELOPMENT OF REAL-TIME MULTIPLEX PCR FOR THE QUANTITATIVE DETERMINATION OF TREC'S AND KREC'S IN WHOLE BLOOD AND IN DRIED BLOOD SPOTSГордуковаМ. А.GordukovaM. A.

Биолог клинической диагностической лаборатории.

Адрес для переписки: Гордукова Мария Александровна ГБУЗ «Детская городская клиническая больница № 9 им. Г.Н. Сперанского 123317, Россия, Москва, Шмитовский проезд, 29. Тел.: 8 (499) 256-21-62. Факс: 8 (499) 256-61-27. E-mail: ma.gordukova@dgkb-9.ru

 

Biologist, Clinical Diagnostic Laboratory.

Address for korrespondence: Gordukova Maria A. G.N.Speranskiy Children Hospital No 9 123317, Russian Federation, Moscow, Shmitovsky str., 29. Phone: 7 (499) 256-21-62. Fax: 7 (499) 256-61-27. E-mail: ma.gordukova@dgkb-9.ru

ma.gordukova@dgkb-9.ruОскорбинИ. П.OskorbinI. P.

Аспирант кафедры молекулярной биологии, Новосибирский государственный исследовательский университе

Graduate Student, Department of Molecular Biology, Novosibirsk State University

ma.gordukova@dgkb-9.ruМишуковаО. В.MishukovaO. V.

Младший научный сотрудник лаборатории фармакогеномики

Junior Research Associate, Pharmacogenomics Laboratory

ma.gordukova@dgkb-9.ruЗиминС. Б.ZiminS. B.

Заведующий отделением иммунопатологии

Head, Department of Immunopathology

ma.gordukova@dgkb-9.ruЗиновьеваН. В.ZinovievaN. V.

Кандидат медицинских наук, заведующая отделением аллергологии и иммунологии

PhD (Medicine), Head, Allergy and Immunology Department

ma.gordukova@dgkb-9.ruДавыдоваН. В.DavydovaN. V.

Кандидат медицинских наук, врач клинической диагностической лаборатории

PhD (Medicine), Doctor, Clinical Diagnostic Laboratory

ma.gordukova@dgkb-9.ruСмирноваА. С.SmirnovaA. S.

Врач клинической диагностической лаборатории

Doctor, Clinical Diagnostic Laboratory

ma.gordukova@dgkb-9.ruНикитинаИ. А.NikitinaI. A.

Заведующая учебной лабораторией кафедры факультетской педиатрии № 2 педиатрического факультета РНИМУ им. Пирогова на базе ГБУЗ «Детская городская клиническая больница № 9 им. Г.Н. Сперанского»

Head, Training Laboratory of Faculty of Pediatrics № 2 of Pirogov Russian National Research Medical University

ma.gordukova@dgkb-9.ruКорсунскийИ. А.KorsunskyI. A.

Кандидат медицинских наук, заведующий московским городским центром детской иммунологии и аллергологии

PhD (Medicine), Head, Moscow City Center for Pediatric Immunology and Allergy

ma.gordukova@dgkb-9.ruФилипенкоМ. Л.FilipenkoM. L.

Кандидат биологических наук, заведующий лабораторией фармакогеномики, Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН; заведующий лабораторией палеогенетики, Новосибирский государственный исследовательский университет

PhD (Biology), Head, Pharmacogenomics Laboratory, nstitute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences; Head, Paleogenetics Laboratory, Novosibirsk State University

ma.gordukova@dgkb-9.ruПродеусА. П.ProdeusA. P.

Доктор медицинских наук, профессор, заместитель главного врача по инфекционным болезням

PhD, MD (Medicine), Professor, Deputy Chief of Infectious Diseases

ma.gordukova@dgkb-9.ruДетская городская клиническая больница № 9 им. Г.Н. Сперанского, МоскваРоссияG.N. Speranskiy Children Hospital No 9, MoscowRussian FederationИнститут химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, Новосибирск; Новосибирский государственный исследовательский университетРоссияInstitute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences, Novosibirsk; Novosibirsk State UniversityRussian FederationИнститут химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, НовосибирскРоссияInstitute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences, NovosibirskRussian Federation201508102015175467478Copyright © Гордукова М.А., Оскорбин И.П., Мишукова О.В., Зимин С.Б., Зиновьева Н.В., Давыдова Н.В., Смирнова А.С., Никитина И.А., Корсунский И.А., Филипенко М.Л., Продеус А.П., 20152015Гордукова М.А., Оскорбин И.П., Мишукова О.В., Зимин С.Б., Зиновьева Н.В., Давыдова Н.В., Смирнова А.С., Никитина И.А., Корсунский И.А., Филипенко М.Л., Продеус А.П.Gordukova M.A., Oskorbin I.P., Mishukova O.V., Zimin S.B., Zinovieva N.V., Davydova N.V., Smirnova A.S., Nikitina I.A., Korsunsky I.A., Filipenko M.L., Prodeus A.P.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.mimmun.ru/mimmun/article/view/935

Первичные иммунодефициты (ПИД), тяжелый комбинированный иммунодефицит (ТКИН) и Х-сцепленная агаммаглобулинемия, характеризуются отсутствием функциональных Ти В-лимфоцитов соответственно. Без своевременной ранней диагностики и лечения дети с ПИД страдают от инфекционных заболеваний с тяжелым течением, что приводит к их инвалидизации или смерти.

Цель: разработать и апробировать на группе детей с верифицированными диагнозами ТКИН и Х-сцепленной агаммаглобулинемией простую, недорогую, высокопропускную методику на основе количественного определения молекул ДНК TREC и KREC с помощью ПЦР в режиме реального времени.

В настоящем исследовании мы разработали и валидировали метод проведения мультиплексной полимеразной цепной реакции в режиме «реального времени» для количественного анализа молекул ДНК TREC и KREC. Нами было показано, что в области концентраций от 109 коп/мл до 5 × 104 коп/мл для всех мишеней наблюдается линейный диапазон изменения Сt в зависимости от концентрации с коэффициентом корреляции R2 не хуже 0,98. Наименьшее количество копий, надежно детектиру емых в одной ПЦР реакции объемом 25 мкл, было: 10 для TREC, 5 для KREC и 5 для внутреннего контроля – локуса IL17RA. Нами определены референсные значения для количества TREC и KREC в цельной крови в зависимости от возраста в группе из 29 мальчиков и 27 девочек с нормальными иммунологическими параметрами. Были определены граничные значения для содержания TREC и KREC в сухих пятнах крови в зависимости от метода экстракции ДНК.

Предложенная методика показала 100% диагностическую чувствительность и специфичность на исследуемой выборке. Метод может быть предложен как скрининговый для диагностики ТКИН и Х-сцепленной агаммаглобулинемии как в цельной крови, так и в сухих пятнах крови. Требуется дальнейшая апробация методики на выборках большего объема. 

Primary immunodeficiencies (PID) such as severe combined immunodeficiency (SCID) and X-linked agammaglobulinemia are characterized by the lack of functional Tand B-cells, respectively. Without early diagnosis and prompt treatment children with PID suffer from severe infectious diseases, leading to their death or disability. Our purpose was developing of simple, inexpensive, high throughput technique based on the quantitative determination of TREC and KREC molecules by real-time PCR, and its validation in a group of children with a verified diagnosis of SCID and X-linked agammaglobulinemia.

In this study, we developed and validated multiplex real-time PCR for the TREC’s and KREC’s quantitative analysis. We have shown that linear range of Ct changes depending on the concentrations of targets with a correlation coefficient R2 not worse than 0.98 was observed at concentrations from 109 to 5 × 104 copies per ml. The lowest amount of targets reliably detected in a reaction volume was 10 TREC’s copies, 5 KREC ‘s copies and 5 copies of internal control (IL17RA). We determined the age-depended reference values of TRECs and KRECs in whole blood in 29 boys and 27 girls with normal immunological parameters. The normal cut-offs for TRECs and KRECs were defined in dry blood spots depending on the method of extraction.

The proposed method showed 100% diagnostic sensitivity and specificity in the studied group. The method can be proposed as a screening tool for the diagnosis of SCID and X-linked agammaglobulinemia both in whole blood and in the dry blood spots. The further investigation is required with larger number of samples. 

первичный иммунодефицитдиагностикаTRECKRECколичественная ПЦРprimary immunodeficiencydiagnosticsTRECKRECreal-time PCRReferencesAlt F.W., Oltz E.M., Young F., Gorman J., Taccioli G., Chen J. VDJ recombination. Immunology Today, 1992, Vol. 11, no. 8, pp. 306-214.Alt F.W., Oltz E.M., Young F., Gorman J., Taccioli G., Chen J. VDJ recombination. Immunology Today, 1992, Vol. 11, no. 8, pp. 306-214.Blackwell T.K., Alt F.W. Mechanism and developmental program of immunoglobulin gene rearrangement in mammals. Annual Review of Genetics, 1989, Vol. 23, pp. 605-636.Blackwell T.K., Alt F.W. Mechanism and developmental program of immunoglobulin gene rearrangement in mammals. Annual Review of Genetics, 1989, Vol. 23, pp. 605-636.Douek D.C., McFarland R.D., Keiser P.H., Gage E.A., Massey J.M., Haynes B.F., Polis M.A., Haase A.T., Feinberg M.B., Sullivan J.L., Jamieson B.D., Zack J.A., Picker L.J., Koup R.A. Changes in thymic function with age and during the treatment of HIV infection. Nature, 1998, Vol. 17, no. 39, pp. 690-695.Douek D.C., McFarland R.D., Keiser P.H., Gage E.A., Massey J.M., Haynes B.F., Polis M.A., Haase A.T., Feinberg M.B., Sullivan J.L., Jamieson B.D., Zack J.A., Picker L.J., Koup R.A. Changes in thymic function with age and during the treatment of HIV infection. Nature, 1998, Vol. 17, no. 39, pp. 690-695.Tonegawa S. Somatic generation of antibody diversity. Nature, 1983, Vol. 302, pp. 575-581.Tonegawa S. Somatic generation of antibody diversity. Nature, 1983, Vol. 302, pp. 575-581.van der Burg M., Tümkaya T., Boerma M., de Bruin-Versteeg S., Langerak A.W., van Dongen J.J. Ordered recombination of immunoglobulin light chain genes occurs at the IGK locus but seems less strict at the IGL locus. Blood, 2001, Vol. 97, pp. 1001-1008.van der Burg M., Tümkaya T., Boerma M., de Bruin-Versteeg S., Langerak A.W., van Dongen J.J. Ordered recombination of immunoglobulin light chain genes occurs at the IGK locus but seems less strict at the IGL locus. Blood, 2001, Vol. 97, pp. 1001-1008.van Zelm M.C., Szczepanski T., van der Burg M., van Dongen J.J. Replication history of B lymphocytes reveals homeostatic proliferation and extensive antigen-induced B cell expansion. The Journal of Experimental Medicine, 2007, Vol. 204, pp. 645-655.van Zelm M.C., Szczepanski T., van der Burg M., van Dongen J.J. Replication history of B lymphocytes reveals homeostatic proliferation and extensive antigen-induced B cell expansion. The Journal of Experimental Medicine, 2007, Vol. 204, pp. 645-655.Amariglio N., Lev A., Simon A., Rosenthal E., Spirer Z., Efrati O., Broides A., Rechavi G., Somech R. Molecular assessment of thymus capabilities in the evaluation of T-cell immunodeficiency. Pediatric Research, 2010, Vol. 67, no. 2, pp. 211-216.Amariglio N., Lev A., Simon A., Rosenthal E., Spirer Z., Efrati O., Broides A., Rechavi G., Somech R. Molecular assessment of thymus capabilities in the evaluation of T-cell immunodeficiency. Pediatric Research, 2010, Vol. 67, no. 2, pp. 211-216.Puck J.M., SCID Newborn Screening Working Group. Population-based newborn screening for severe combined immunodeficiency: steps toward implementation. Journal of Allergy and Clinical Immunology, 2007, Vol. 120, no. 4, pp. 760-768.Puck J.M., SCID Newborn Screening Working Group. Population-based newborn screening for severe combined immunodeficiency: steps toward implementation. Journal of Allergy and Clinical Immunology, 2007, Vol. 120, no. 4, pp. 760-768.Roifman C.M., Somech R., Grunebaum E. Matched unrelated bone marrow transplant for T+ combined immunodeficiency. Bone Marrow Transplantation, 2008, Vol. 41, pp. 947-952.Roifman C.M., Somech R., Grunebaum E. Matched unrelated bone marrow transplant for T+ combined immunodeficiency. Bone Marrow Transplantation, 2008, Vol. 41, pp. 947-952.Baker M.W., Grossman W.J., Laessig R.H., Hoffman G.L., Brokopp C.D., Kurtycz D.F., Cogley M.F., Litsheim T.J., Katcher M.L., Routes J.M. Development of a routine newborn screening protocol for severe combined immunodeficiency. Journal of Allergy and Clinical Immunology, 2009, Vol. 124, no. 3, pp. 522-527.Baker M.W., Grossman W.J., Laessig R.H., Hoffman G.L., Brokopp C.D., Kurtycz D.F., Cogley M.F., Litsheim T.J., Katcher M.L., Routes J.M. Development of a routine newborn screening protocol for severe combined immunodeficiency. Journal of Allergy and Clinical Immunology, 2009, Vol. 124, no. 3, pp. 522-527.Sottini A., Ghidini C., Zanotti C., Chiarini M., Caimi L., Lanfranchi A., Moratto D., Porta F., Imberti L. Simultaneous quantification of recent thymic T-cell and bone marrow B-cell emigrants in patients with primary immunodeficiency undergone to stem cell transplantation. Clinical Immunology, 2010, Vol. 136, no 2, pp. 217-227.Sottini A., Ghidini C., Zanotti C., Chiarini M., Caimi L., Lanfranchi A., Moratto D., Porta F., Imberti L. Simultaneous quantification of recent thymic T-cell and bone marrow B-cell emigrants in patients with primary immunodeficiency undergone to stem cell transplantation. Clinical Immunology, 2010, Vol. 136, no 2, pp. 217-227.Borte S., von Döbeln U., Fasth A., Wang N., Janzi M., Winiarski J., Sack U., Pan-Hammarström Q., Borte M., Hammarström L. Neonatal screening for severe primary immunodeficiency diseases using high-throughput triplex real-time PCR. Blood, 2012, Vol. 119, no 11, pp. 2552-2555.Borte S., von Döbeln U., Fasth A., Wang N., Janzi M., Winiarski J., Sack U., Pan-Hammarström Q., Borte M., Hammarström L. Neonatal screening for severe primary immunodeficiency diseases using high-throughput triplex real-time PCR. Blood, 2012, Vol. 119, no 11, pp. 2552-2555.Lang P.O., Govind S., Dramé M., Aspinall R. Comparison of manual and automated DNA purification for measuring TREC in dried blood spot (DBS) samples with qPCR. Journal of Immunological Methods, 2012, Vol. 384, no. 1-2, pp. 118-127.Lang P.O., Govind S., Dramé M., Aspinall R. Comparison of manual and automated DNA purification for measuring TREC in dried blood spot (DBS) samples with qPCR. Journal of Immunological Methods, 2012, Vol. 384, no. 1-2, pp. 118-127.Ou X., Zhao H., Sun H., Yang Z., Xie B., Shi Y., Wu X. Detection and quantification of the age-related sjTREC decline in human peripheral blood. International Journal of Legal Medicine, 2011, Vol. 125, pp. 603-608.Ou X., Zhao H., Sun H., Yang Z., Xie B., Shi Y., Wu X. Detection and quantification of the age-related sjTREC decline in human peripheral blood. International Journal of Legal Medicine, 2011, Vol. 125, pp. 603-608.Ou X.L., Gao J., Wang H., Wang H.S., Lu H.L., Sun H.Y. Predicting human age with bloodstains by sjTREC quantification. PLoS ONE, 2012, Vol. 7, no. 8, p. e42412.Ou X.L., Gao J., Wang H., Wang H.S., Lu H.L., Sun H.Y. Predicting human age with bloodstains by sjTREC quantification. PLoS ONE, 2012, Vol. 7, no. 8, p. e42412.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.