Экспрессия генов цитокинов во фракциях клеток костного мозга, изолированных с помощью противоточного центрифугирования в элютриаторном роторе

По своему клеточному составу красный костный мозг состоит из чрезвычайно гетерогенной популяции клеток, включающей стволовые клетки, клетки ретикулярной стромы и клетки пяти кроветворных ростков. Для клеточной терапии и экспериментальных исследований актуальной задачей является получение клеточных фракций костного мозга, обогащенных определенным типом клеток. В данной работе мы исследовали уровень экспрессии мРНК генов цитокинов во фракциях клеток костного мозга, изолированных с помощью противоточного центрифугирования в элютриаторном роторе. Фракционирование клеток выполняли при скорости вращения ротора 2500 об/ мин. Отбирали шесть клеточных фракций (Ф): Ф-1 при скорости потока буфера 12 мл/мин, Ф-2 – 15 мл/ мин, Ф-3 – 19 мл/мин, Ф-4 – 23 мл/мин, Ф-5 – 50 мл/мин, Ф-6 – собирали после остановки вращения ротора. Цитоморфологический анализ полученных фракций показал, что из общей популяции клеток в «легкой» фракции Ф-1 концентрируется 80% эритроцитов и 40% лимфоцитов, в Ф-2 – 44% лимфоцитов, 50% – полихроматофильных и 51% – оксифильных нормоцитов, в Ф-3 и Ф-4 – 70% нейтрофилов и 40% – эозинофильных гранулоцитов, в Ф-6 – 64% макрофагов, 95% – мегакариоцитов, 35% – ретикулярных и 62% – тучных клеток. Бластные клетки разных ростков кроветворения обнаружены преимущественно в Ф-5. С помощью RT-PCR максимальная экспрессия генов фактора стволовых клеток (Scf) и гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (Gm-csf) выявлена в «тяжелой» фракции Ф-6, фактора некроза опухолей (Tnfα) и эритропоэтина (Epo) – в Ф-4, Ф-5 и Ф-6, макрофагального колониестимулирующего фактора (M-csf) – в Ф-3 и Ф-4. Таким образом, данный метод позволяет эффективно отделить «легкие» фракции лимфоцитов и эритроцитов от основной массы клеток костного мозга, что может быть использовано при аллогенной трансплантации клеток костного мозга для снижения риска развития острой реакции «трансплантат против хозяина». Другим важным преимуществом метода является возможность получить фракции «тяжелых» клеток, обладающих регенеративным потенциалом, с целью их использования в клеточной терапии для стимуляции восстановительных процессов в органах и тканях.

1. Vladimirsky E.B. Normal hematopoiesis and its regulation. Klinicheskaya onkogematologiya = Clinical Oncohematology, 2015, Vol. 8, no. 2, pp. 109-119. (In Russ.)

2. Goldberg E.D., Dygai A.M., Shakhov V.P. Methods of tissue culture in hematology. Tomsk: Tomsk State University, 1992. 272 p.

3. Kladova I.V., Kivva V.N., Khripoun A.V., Сhernikova I.V., Strahova N.B., Antipova N.V., Beloborodovа T.P., Vorobyov I.Yu. Neuroprotective effects of erythropoietin: opportunities, prospects and reality (review). Meditsinskiy vestnik yuga Rossii = Medical Herald of the South of Russia, 2014, no. 3, pp. 28-35. (In Russ.)

4. Maslov L.N., Sazonova S.I. Using cytokines to stimulate neoangiogenesis and cardiac regeneration. Eksperimentalnaya i klinicheskaya farmakologiya = Experimental and Clinical Pharmacology, 2006, no. 5, pp. 70-76. (In Russ.)

5. Bolliger А.P. Cytologic evaluation of bone marrow in rats: indications, methods, and normal morphology. Vet. Clin. Pathol., 2004, Vol. 33, no. 2, pp. 58-67.

6. Braza M.S., Conde P., Garcia M., Cortegano I., Brahmachary M., Pothula V.F., Fay F., Boros P., Werner S.A., Ginhoux F., Mulder W.J.M., Ochando J. Neutrophil derived CSF1 induces macrophage polarization and promotes transplantation tolerance. Am. J. Transplant., 2018, Vol. 18, no. 5, pp. 1247-1255.

7. Centrifugal elutriation. In: Burdon R.H., van Knippenberg P.H., Sharpe P.T. (eds.). Methods of cell separation. Laboratory techniques in biochemistry and molecular biology. Elsevier, 1988, pp. 91-106.

8. Chakraborty P., Wang Y., Wei J.H., van Deursen J., Yu H., Malureanu L., Dasso M., Forbes D.J., Levy D.E., Seemann J., Fontoura B.M.A. Nucleoporin levels regulate cell cycle progression and phase-specific gene expression. Dev. Cell, 2008, Vol. 15, pp. 657-667.

9. de Witte T., Plas A., Koekman E., Blankenborg G., Salden M., Wessels J., Haanen C. Separation of human bone marrow by counterflow centrifugation monitored by DNA-flowcytometry. Br. J. Haematol., 1984, Vol. 58, no. 2, pp. 249-258.

10. de Witte T., Hoogenhout J., de Pauw B., Holdrinet R., Janssen J., Wessels J., van Daal W., Hustinx T., Haanen C. Depletion of donor lymphocytes by counterflow centrifugation successfully prevents acute graft-versushost disease in matched allogeneic marrow transplantation. Blood, 1986, Vol. 67, no. 5, pp. 1302-1308.

11. Gengozian N., Legendre A.M. Separation of feline bone marrow cells by counterflow centrifugal elutriation. Identification and isolation of presumptive early and late myeloid/erythroid progenitors. Transplantation, 1995, Vol. 60, no. 8, pp. 836-841.

12. Goldenberg-Cohen N., Iskovich S., Askenasy N. Bone marrow homing enriches stem cells responsible for neogenesis of insulin-producing cells, while radiation decreases homing efficiency. Stem Cells Dev., 2015, Vol. 24, no. 19, pp. 2297-2306.

13. Khansari N., Beauclair K., Gustad T. Separation of bovine lymphocytes and granulocytes from blood by use of elutriation. Am. J. Vet. Res., 1989, Vol. 50, no. 8, pp. 1263-1265.

14. Lindahl P.E. Principle of a counter-streaming centrifuge for the separation of particles of different sizes. Nature, 1948, Vol. 161, pp. 648-650.

15. Michalopoulos G.K. Principles of liver regeneration and growth homeostasis. Compr. Physiol., 2013, Vol. 3, no. 1, pp. 485-513.

16. Orlic D., Kajstura J., Chimenti S., Limana F., Jakoniuk I., Quaini F., Nadal-Ginard B., Bodine D.M., Leri A., Anversa P. Mobilized bone marrow cells repair the infarcted heart, improving function and survival. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2001, Vol. 98, no. 18, pp. 10344-10349.

17. Schirrmacher, V. Bone Marrow: The Central Immune System. Immuno, 2023, Vol. 3, no. 3, pp. 289-329.

18. Stroncek D.F., Fellowes V., Pham C., Khuu H., Fowler D.H., Wood L.V., Sabatino M. Counter-flow elutriation of clinical peripheral blood mononuclear cell concentrates for the production of dendritic and T cell therapies. J. Transl. Med., 2014, Vol. 12, 241. doi: 10.1186/s12967-014-0241-y.

19. Usynin I., Frevert U., Klotz C. Malaria circumsporozoite protein inhibits respiratory burst in Kupffer cells. Cell Microbiol., 2007, Vol. 9, no. 11, pp. 2610-2628.

20. Zahorchak A.F., DeRiggi M.L., Muzzio J.L., Sutherland V., Humar A., Lakkis F.G., Hsu Y.S., Thomson A.W. Manufacturing and validation of Good Manufacturing Practice-compliant regulatory dendritic cells for infusion into organ transplant recipients. Cytotherapy, 2023, Vol. 25, no. 4, pp. 432-441.