ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ ЦИТОКИНОВ ВО ФРАКЦИЯХ КЛЕТОК КОСТНОГО МОЗГА, ИЗОЛИРОВАННЫХ С ПОМОЩЬЮ ПРОТИВОТОЧНОГО ЦЕНТРИФУГИРОВАНИЯ В ЭЛЮТРИАТОРНОМ РОТОРЕ

Резюме

По своему клеточному составу красный костный мозг состоит из чрезвычайно гетерогенной популяции клеток, включающей стволовые клетки, клетки ретикулярной стромы и клетки пяти кроветворных ростков. Для клеточной терапии и экспериментальных исследований актуальной задачей является получение клеточных фракций костного мозга, обогащенных определенным типом клеток. В данной работе мы исследовали уровень экспрессии мРНК генов цитокинов во фракциях клеток костного мозга, изолированных с помощью противоточного центрифугирования в элютриаторном роторе. Фракционирование клеток выполняли при скорости вращения ротора 2500 об/мин. Отбирали шесть клеточных фракций (Ф): Ф-1 при скорости потока буфера 12 мл/мин, Ф-2 – 15 мл/мин, Ф-3 – 19 мл/мин, Ф-4 – 23 мл/мин, Ф-5 – 50 мл/мин, Ф-6 – собирали после остановки вращения ротора. Цитоморфологический анализ полученных фракций показал, что из общей популяции клеток в «легкой» фракции Ф-1 концентрируется 80% эритроцитов и 40% лимфоцитов, в Ф-2 – 44% лимфоцитов, 50% полихроматофильных и 51% оксифильных нормоцитов, в Ф-3 и Ф-4 – 70% нейтрофилов и 40% эозинофильных гранулоцитов, в Ф-6 – 64% макрофагов, 95% мегакариоцитов, 35% ретикулярных и 62% тучных клеток. Бластные клетки разных ростков кроветворения обнаружены преимущественно в Ф-5. С помощью RT-PCR максимальная экспрессия генов фактора стволовых клеток (Scf) и гранулоцитарно-макрофагального  колониестимулирующего фактора (Gm-csf) выявлена в «тяжелой» фракции   Ф-6, фактора некроза опухолей (Tnf-α) и эритропоэтина (Epo) – в Ф-4, Ф-5 и Ф-6,  макрофагального колониестимулирующего фактора (M-csf) – в Ф-3 и Ф-4. Таким образом, данный метод позволяет эффективно отделить «легкие» фракции лимфоцитов и эритроцитов от основной массы клеток костного мозга, что может быть использовано при аллогенной трансплантации клеток костного мозга для снижения риска развития острой реакции «трансплантат против хозяина». Другим важным преимуществом метода является возможность получить фракции «тяжелых» клеток, обладающих регенеративным потенциалом, с целью их использования в клеточной терапии для стимуляции восстановительных процессов в органах и тканях.

1. Владимирская Е.Б. Нормальное кроветворение и его регуляция // Клиническая онкогематология, 2015. Т. 8, № 2. С. 109–119. Vladimirsky E.B. Normal Hematopoiesis and Its Regulation. Clinical oncohematology, 2015, Vol.8, no. 2, pp. 109–119. (In Russ.) . doi: 10.21320/2500-2139-2015-8-2-109-119

2. Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., Шахов В.П. Методы культуры ткани в гематологии. Томск : Изд-во ТГУ, 1992. 272 с. Goldberg E. N., Dygai A.M., Shakhov V.P. Methods of tissue culture in hematology, Tomsk, 1992, 272 p. Tomsk: Tomsk State University, 1992. (In Russ.) https://search.rsl.ru/ru/record/01001635472

3. Кладова И.В., Кивва В.Н., Хрипун А.В., Черникова И.В., Страхова Н.Б., Антипова Н.В., Белобородова Т.П., Воробьев И.Ю. Нейропротективные эффекты эритропоэтина: возможности, перспективы и реальность // Медицинский вестник юга России. 2014. № 3. С. 28-35. Kladova I, Kivva V., Khripoun A., Сhernikova I., Strahova N., Antipova N., Beloborodovа T., Vorobyov I. Neuroprotective effects of erythropoietin: opportunities, prospects and reality (review). Medical Herald of the South of Russia. 2014, Vol.3, pp. 28-35. (In Russ.) https://www.medicalherald.ru/jour/article/view/31?locale=ru_RU

4. [doi: 10.21886/2219-8075-2014-3-28-35]

5. Маслов Л.Н., Сазонова С.И. Использование цитокинов для стимуляции неоангиогенеза и регенерации сердца // Экспериментальная и клиническая фармакология, 2006. № 5. С.70-76. Maslov L.N., Sazonova S.I. Using cytokines to stimulate neoangiogenesis and cardiac regeneration

6. // Experimental and Clinical Pharmacology, 2006, No. 5, pp. 70-76. www.ekf.folium.ru/index.php/ekf/article/view/1058

7. [https://doi.org/10.30906/0869-2092-2006-69-5-70-76]

8. Bolliger АP. Cytologic evaluation of bone marrow in rats: indications, methods, and normal morphology. Vet. Clin. Pathol., 2004, Vol.33, no. 2, pp. 58-67. _ doi: 10.1111/j.1939-165x.2004.tb00351.x

9. Braza M. S., Conde P., Garcia M., Cortegano I., Brahmachary M., Pothula V. F., Fay F., Boros P., Werner S. A., Ginhoux F., Mulder W. J.M., Ochando J. Neutrophil derived CSF1 induces macrophage polarization and promotes transplantation tolerance. American journal of transplantation, 2018, Vol.18, no. 5, pp. 1247-1255. _ doi:10.1111/ajt.14645

10. Chakraborty P., Wang Y., Wei J.H., van Deursen J. Yu H., Malureanu L., et al. Nucleoporin levels regulate cell cycle progression and phase-specific gene expression. Developmental cell, 2008, Vol. 15, pp. 657–667. _ doi; 10.1016 /j. devcel. 2008. 08. 020

11. De Witte T, Plas A, Koekman E, Blankenborg G, Salden M, Wessels J, Haanen C. Separation of human bone marrow by counterflow centrifugation monitored by DNA-flowcytometry. Br. J.Haematol., 1984, Vol. 58, no. 2, pp. 249-258. _ https://onlinelibrary.wiley.com/doi/epdf/10.1111/j.1365-2141.1984.tb06083.x

12. или

13.

14. https://doi.org/10.1111/j.1365-2141.1984.tb06083.x

15. De Witte T, Hoogenhout J, de Pauw B, Holdrinet R, Janssen J, Wessels J, van Daal W, Hustinx T, Haanen C. Depletion of donor lymphocytes by counterflow centrifugation successfully prevents acute graft-versus-host disease in matched allogeneic marrow transplantation. Blood, 1986, Vol. 67, no. 5, pp. 1302-1308. _ https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0006497120798502?via%3Dihub

16. [https://doi.org/10.1182/blood.V67.5.1302.1302]

17. Gengozian N, Legendre AM. Separation of feline bone marrow cells by counterflow centrifugal elutriation. Identification and isolation of presumptive early and late myeloid/erythroid progenitors. Transplantation, 1995, Vol. 60, no. 8, pp. 836-841. _ https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/7482744/

18. Goldenberg-Cohen N, Iskovich S, Askenasy N. Bone Marrow Homing Enriches Stem Cells Responsible for Neogenesis of Insulin-Producing Cells, While Radiation Decreases Homing Efficiency. Stem Cells Dev., 2015, Vol. 24, no. 19, pp. 2297-2306. _ https://www.liebertpub.com/doi/10.1089/scd.2014.0524

19. [https://doi.org/10.1089/scd.2014.0524]

20. Khansari N, Beauclair K, Gustad T. Separation of bovine lymphocytes and granulocytes from blood by use of elutriation. Am. J. Vet. Res., 1989, Vol. 50, no. 8, pp. 1263-1265. _ https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/2782710/

21. Lindahl, P.E. Principle of a Counter-Streaming Centrifuge for the Separation of Particles of Different Sizes. Nature, 1948, Vol. 161, pp. 648–650. _ https://www.nature.com/articles/161648a0

22. [doi: 10.1038/161648a0]

23. Michalopoulos G.K. Principles of liver regeneration and growth homeostasis. Compr. Physiol., 2013, Vol. 3, no. 1, pp. 485-513. _ https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/23720294/

24. или

25. https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/cphy.c120014

26. [DOI: 10.1002/cphy.c120014]

27. Orlic D, Kajstura J, Chimenti S, Limana F, Jakoniuk I, Quaini F, Nadal-Ginard B, Bodine DM, Leri A, Anversa P. Mobilized bone marrow cells repair the infarcted heart, improving function and survival. Proc. Natl. Acad. Sci., U S A, 2001, Vol. 98, no. 18, pp. 10344-10349. _ https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/11504914/

28. или

29. https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC56963/

30. [doi: 10.1073 / pnas.181177898]

31. Schirrmacher, V. Bone Marrow: The Central Immune System. Immuno, 2023, Vol. 3, pp. 289–329. _ https://www.mdpi.com/2673-5601/3/3/19

32. [doi:10.3390/immuno3030019].

33. Sharpe P.T. Methods of Cell Separation. Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Chapter 5. Centrifugal elutriation. Elsevier, 1988, pp. 91-106. _ https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0075753508706302

34. [https://doi.org/10.1016/S0075-7535(08)70630-2.]

35. Stroncek DF, Fellowes V, Pham C, Khuu H, Fowler DH, Wood LV, Sabatino M. Counter-flow elutriation of clinical peripheral blood mononuclear cell concentrates for the production of dendritic and T cell therapies. J. Transl. Med., 2014, Vol. 12, pp. 41. _ https://translational-medicine.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12967-014-0241-y

36. [doi: 10.1186/s12967-014-0241-y.]

37. Usynin I., Frevert U, Klotz C. Malaria circumsporozoite protein inhibits respiratory burst in Kupffer cells. Cell Microbiol. 2007, Vol. 9, no. 11, pp. 2610-2628. _ https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/17573905/

38. [doi:10.1111/j.1462-5822.2007.00982.x.]

39. Zahorchak AF, DeRiggi ML, Muzzio JL, Sutherland V, Humar A, Lakkis FG, Hsu YS, Thomson AW. Manufacturing and validation of Good Manufacturing Practice-compliant regulatory dendritic cells for infusion into organ transplant recipients. Cytotherapy. 2023, Vol. 25, no. 4, pp. 432-441. _

40. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36639251/

41. DOI: 10.1016/j.jcyt.2022.11.005]