ВЛИЯНИЕ ЭЛЕКТРОПОРАЦИИ ДНК КОНСТРУКЦИЯМИ НА ДЕНДРИТНЫЕ КЛЕТКИ

На сегодняшний день, трансфекция клеток млекопитающих ДНК или РНК конструкциями является единственным методом доставки запрограммированной информации в ядро клетки. Одним из часто используемых методов трансфекции в работе с дендритными клетками, является электропорация. Суть метода состоит в повышении проницаемости мембраны путем проведения электрического импульса через клетку. В связи с повышенной проницаемостью мембраны повышается шанс попадания ДНК или РНК конструкций внутрь клетки, но при этом снижается выживаемость клетки после воздействия тока на плазматическую мембрану клетки.

В исследовании использовали мышей самцов линии C57Bl/6 возраста 2-4 месяца. Из бедренной кости мышей выделяли 20 × 10⁶ клеток костного мозга, после клетки культивировали в полной RPMI1640 среды в течение 7 суток. Для генерации дендритных клеток из клеток костного мозга, в культуральную среду добавляли 100 нг/мл rmFlt3-L на 0 день. После 7 дней культивирования, клеточную культуру электропорировали контрольными некодирующими плазмидами p5 (EP P5) или пламзмидами pmaxCCR9 (EP CCR9), кодирующими мышиный рецептор хемотаксиса CCR9. В качестве контролей выступали, клеточные культуры электропорированные без плазмид (mock EP) и культуры клеток без электропорации (none EP). Электропорировали 5 × 10⁵ клеток и оставляли на 10 минут. После 10 минут клетки собирались и рассаживались в 24-луночном планшете в 1 мл культуральной среды и кондиционной среды (1:1). Затем добавляли по 50 нг/мл Flt3-L в каждую лунку. На следующий день трансфицированные клетки оценивались с помощью метода проточной цитофлуориметрии и количественной ПЦР.

Установлено, что после электропорации в группах mock EP, EP P5, EP CCR9 относительное количество живых CD11c⁺ дендритных клеток было достоверно меньше, чем в non EP группе. Более того, в группах EP P5 и EP CCR9 было достоверно меньше живых CD11c+ дендритных клеток, чем в группе mock EP. Экспрессия маркера CD86 было достоверно выше в группах EP P5 и EP CCR9, чем в группах non EP и mock EP. Экспрессия I-Ab среди cDC2s было достоверно выше в группе EP CCR9 по сравнению с группой non EP. У плазмацитоидных дендритных клеток и конвенциональных дендритных клеток 2-го типа, в группах EP CCR9, экспрессия CCR9 была достоверно выше, чем в группе non EP.

Таким образом, в данном исследовании продемонстрирована эффективность электропорации, сопровождающаяся снижением выживаемости и созреванием дендритных клеток. 

1. Baravalle G., Park H., McSweeney M., Ohmura-Hoshino M., Matsuki Y., Ishido S., Shin J.-S. Ubiquitination of CD86 is a key mechanism in regulating antigen presentation by dendritic cells. J. Immunol., 2011, Vol. 187, pp. 2966-2973.

2. Casares D., Escribá P.V., Rosselló C.A. Membrane lipid composition: effect on membrane and organelle structure, function and compartmentalization and therapeutic avenues. Int. J. Mol. Sci., 2019, Vol. 20, 2167. doi: 10.3390/ijms20092167.

3. Drakes M.L., Stiff P.J., Blanchard T.G. Inverse relationship between dendritic cell CCR9 expression and maturation state. Immunology, 2009, Vol. 127, pp. 466-476.

4. Kadir L.A., Stacey M., Barrett-Jolley R. Emerging roles of the membrane potential: action beyond the action potential. Front. Physiol., 2018, Vol. 9, 1661. doi: 10.3389/fphys.2018.01661.

5. Lenz P., Bacot S.M., Frazier-Jessen M.R., Feldman G.M. Nucleoporation of dendritic cells: efficient gene transfer by electroporation into human monocyte-derived. FEBS Lett., 2003, Vol. 538, no. 1-3, pp. 149-154.

6. Li J.G., Du Y.M., Yan Z.D., Yan J., Zhuansun Y.X., Chen R., Zhang W., Feng S.L., Ran P.X. CD80 and CD86 knockdown in dendritic cells regulates Th1/Th2 cytokine production in asthmatic mice. Exp. Ther. Med., 2016, Vol. 11, pp. 878-884.

7. Livak K.J., Schmittgen T.D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods, 2001, Vol. 25, pp. 402-408.

8. Milano F., Krishnadath K.K. Electroporation of dendritic cells with autologous total RNA from tumor material. Methods Mol. Biol., 2014, Vol. 1139, pp. 87-95.

9. Molnar M.J., Gilbert R., Lu Y. Factors influencing the efficacy, longevity, and safety of electroporationassisted plasmid-based gene transfer into mouse muscles. Mol. Ther., 2004, Vol. 10, pp. 447-455.

10. Panagiotopoulou V. Study on cell membrane electrostatics and transport. Book, Lambert Academic Publishing, 2015. 98 p.

11. Patente T.A., Pelgrom L.R., Everts B. Dendritic cells are what they eat: how their metabolism shapes T helper cell polarization. Curr. Opin. Immunol., 2019, Vol. 58, pp. 16-23.

12. Pearce E.J., Everts B. Dendritic cell metabolism. Nat. Rev. Immunol., 2015, Vol. 15, pp. 18-29.

13. Rols M.P. Parameters affecting cell viability following electroporation in vitro. Handbook of Electroporation, Springer International Publishing, 2017, pp. 1449-1465.

14. Sukharev S.I., Klenchin V.A., Serov S.M., Chernomordik L.V., Chizmadzhev Y.A. Electroporation and electrophoretic DNA transfer into cells. Biophys. J., 1992, Vol. 63, pp. 1320-1327.