ВЫЯВЛЕНИЕ МАРКЕРОВ РЕПЛИКАЦИИ ВИРУСА ГЕПАТИТА С В МОНОНУКЛЕАРНЫХ КЛЕТКАХ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ БОЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКИМ ГЕПАТИТОМ С

Резюме. Цель работы состояла в экспериментальной оценке роли инфицирования мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК) вирусом гепатита С (ВГС) в прогрессировании заболевания хроническим гепатитом С (ХГС). Для этого в клетках больных ХГС выявляли структурный core-белок и неструктурные белки ВГС, входящие в репликативный комплекс, а также геномные и репликативные цепи РНК ВГС. Исследованы образцы крови от 83 пациентов с ХГС, находящихся на разных стадиях заболевания. Белки ВГС в МКПК выявляли при помощи методов иммуноцито-химического окрашивания и проточной цитофлуориметрии с использованием 17 моноклональных антител. Геномные и репликативные цепи РНК ВГС определяли методом ОТ-ПЦР. Белки ВГС были выявлены в МКПК у 86% больных ХГС. Наиболее часто обнаруживали белок NS5A. Вирусные белки были локализованы исключительно в цитоплазме клеток крови, преимущественно в моноцитах, количество ВГС-позитивных лимфоцитов было существенно ниже. Геномные цепи РНК ВГС были выявлены в МКПК 95% пациентов, репликативные – в клетках 51% пациентов. Статистический анализ позволил установить достоверную прямую корреляцию между накоплением вирусных белков в МКПК и показателями активности и стадиями гепатита С: уровень аланинаминотрансферазы, индекс гистологической активности и степень фиброза печени. У большинства больных отмечен дисбаланс в соотношении числа лимфоцитов и моноцитов. Накопление в МКПК белков ВГС достоверно коррелировало со снижением общего количества мононуклеаров. Полученные данные позволяют сделать вывод, что МКПК являются местом активной репликации вируса, что может вызывать иммунные расстройства и усиливать тяжесть течения ХГС.

белки ВГС, РНК ВГС, мононуклеарные клетки периферической крови, моноклональные антитела

1. Масалова О.В., Абдулмеджидова А.Г., Атанадзе С.Н., Уланова Т.И., Бурков А.Н., Худяков Ю.Е., Fields H., Кущ А.А. Характеристика панели моноклональных антител и эпитопное картирование белков вируса гепатита С // Доклады Академии Наук. – 2002. – Т. 383 (4). – С. 545-550.

2. Масалова О.В., Абдулмеджидова А.Г., Шкурко Т.В., Келли Е.И., Атанадзе С.Н., Завалишина Л.Э., Франк Г.А., Кузина О.В., Львов Д.К., Кущ А.А. Анализ белков вируса гепатита С в клетках печени больных хроническим гепатитом С // Вопр. вирусологии. – 2003. – Т. 48, № 1. – С. 9-14.

3. Масалова О.В., Кущ А.А. Моноклональные антитела к белкам вируса гепатита С – инструмент для картирования антигенных детерминант, диагностики гепатита С и изучения вирусного патогенеза // Рос. биотерапевтический журн. – 2003. – № 3. – С. 7-23.

4. Лакина Е.И., Самохвалов Е.И., Левченко О.Г., Масалова О.В., Климова Е.А., Знойко О.О., Ющук Н.Д., Львов Д.К., Кущ А.А. Выявление положительных (геномных) и отрицательных (репликативных) цепей РНК вируса гепатита С в сыворотке крови, лимфоцитах и ткани печени больных хроническим гепатитом С с помощью полимеразной цепной реакции // Вопр. вирусологии. – 2000. – Т. 45, № 4. – С. 37-42.

5. Речкина Е.А., Денисова Г.Ф., Масалова О.В., Лидеман Л.Ф., Денисов Д.А., Леснова Е.И., Атауллаханов Р.И., Гурьянова С.В., Кущ А.А. Картирование антигенных детерминант белков вируса гепатита С при помощи технологии фагового дисплея // Молекуляр. биология. – 2006. – Т. 40, № 2. – С. 357-368.

6. Agnello V., Abel G., Elfahal M., Knight G.B., Zhang Q.X. Hepatitis C virus and other flaviviridae viruses enter cells via low density lipoprotein receptor // Proc. Natl. Acad. Sci. USA – 1999. – Vol. 96. – P. 12766-12771.

7. Appel N., Schaller T., Penin F., Bartenschlager R. From structure to function: new insights into hepatitis C virus RNA replication // J. Biol. Chem. – 2006. – Vol. 281. – P. 9833-9836.

8. Baré P., Massud I., Parodi C., Belmonte L., García G., Nebel M.C., Corti M., Pinto M.T., Bianco R.P., Bracco M.M., Campos R., Ares B.R. Continuous release of of hepatitis C virus (HCV) by peripheral blood mononuclear cells and B-lymphoblastoid cell-line cultures derived from HCV-infected patients // J. Gen. Virol. – 2005. – Vol. 86. – P. 1717-1727.

9. Cavalheiro N. de P., Filgueiras T.C., Melo C.E., Morimitsu S.R., Araújo E.S., Tengan F.M., Barone A.A. Detection of HCV by PCR in serum and PBMC of patients with hepatitis C after treatment // Braz. J. Infect. Dis. – 2007. – Vol. 11. – P. 471-474.

10. Crovatto M., Pozzato G., Zorat F., Pussini E., Nascimben F., Baracetti S., Grando M.G., Mazzaro C., Reitano M., Modolo M.L., Martelli P., Spada A., Santini G. Peripheral blood neutrophils from hepatitis C virus-infected patients are replication sites of the virus // Haematologica. – 2000. – Vol. 85, N 4. – P. 356-361.

11. El-Awady M.K., Tabll A.A., Redwan el-R.M., Youssef S., Omran M.H., Thakeb F., el-Demellawy M. Flow cytometric detection of hepatitis C virus antigens in infected peripheral blood leukocytes: binding and entry // World J. Gastroenterol. – 2005. – Vol. 11. – P. 5203-5208.

12. Gong G.Z., Lai L.Y., Jiang Y.F., He Y., Su X.S. HCV replication in PBMC and its influence on interferon therapy // World J. Gastroenterol. – 2003. – Vol. 9. – P. 291-294.

13. Intraobserver and interobserver variations in liver biopsy interpretation in patients with chronic hepatitis C. The French METAVIR Cooperative Study Group // Hepatology. – 1994. – Vol. 20. – P. 15-20.

14. Lanford R.E., Chavez D., Chisari F.V., Sureau C. Lack of detection of negative-strand hepatitis C virus RNA in peripheral blood mononuclear cells and other extrahepatic tissues by the highly strand-specific rTth reverse transcriptase PCR // J. Virol. – 1995. – Vol. 69. – P. 8079-8083.

15. Meier V., Mihm S., Braun Wietzke P., Ramadori G. HCV-RNA positivity in peripheral blood mononuclear cells of patients with chronic HCV infection: does it really mean viral replication? // World J. Gastroenterol. – 2001. – Vol. 7. – P. 228-234.

16. Navas S., Castillo I., Bartolome J., Marriott E., Herrero M., Carreno V. Positive and negative hepatitis C virus RNA strands in serum, liver and peripheral blood mononuclear cells in anti-HCV patients: relation with the liver lesion // Hepatology. – 1994. – Vol. 21. – P. 182-186.

17. Ohno O., Mizokami M., Wu R.R., Saleh M.G., Ohba K., Orito E., Mukaide M., Williams R., Lau J.Y. New hepatitis C virus (HCV) genotyping system that allows for identification of HCV genotypes 1a, 1b, 2a, 2b, 3a, 3b, 4, 5a, and 6a // J. Clin. Microbiol. – 1997. – Vol. 35, N 1. – P. 201-207.

18. Okamoto H., Okada S., Sugiyama Y., Tanaka T., Sugai Y., Akahane Y., Machida A., Mishiro S., Yoshizawa H., Miyakawa Y. Detection of hepatitis C virus RNA by a two-stage polymerase chain reaction with two pairs of primers deduced from the 5'-noncoding region // Jpn. J. Exp. Med. – 1990. – Vol. 60. – P. 215-222.

19. Pugnale P., Latorre P., Rossi C., Crovatto K., Pazienza V., Gottardi A.D., Negro F. Real-time multiplex PCR assay to quantify hepatitis C virus RNA in peripheral blood mononuclear cells // J. Virol. Methods. – 2006. – Vol. 133. – P. 195-204.

20. Sansonno D., Iacobelli A.R., Cornacchiulo V., Iodice G., Dammacco F. Detection of hepatitis C virus (HCV) proteins by immunofluorescence and HCV RNA genomic sequences by non-isotopic in situ hybridization in bone marrow and peripheral blood mononuclear cells of chronically HCV-infected patients // Clin. Exp. Immunol. – 1996. – Vol. 103. – P. 414-421.

21. Taya N., Torimoto Y., Shindo M., Hirai K., Hasebe C., Kohgo Y. Fas-mediated apoptosis of peripheral blood mononuclear cells in patients with hepatitis C // Br. J. Haematol. – 2000. – Vol. 110. – P. 89-97.

22. Tian D., Yang D., Wang W., Xia Q., Shi S., Song P., Theilmann L. Extrahepatic and intrahepatic replication and expression of hepatitis C virus // J. Tongji Med. Univ. – 1998. – Vol. 18. – P. 149-152.

23. Willems M., Peerlinck K., Moshage H., Deleu I., Van den Eynde C., Vermylen J., Yap S.H. Hepatitis C virus-RNAs in plasma and in peripheral blood mononuclear cells of hemophiliacs with chronic hepatitis C: evidence for viral replication in peripheral blood mononuclear cells // J. Med. Virol. – 1994. – Vol. 42. – P. 272-278.