ПРИМЕНЕНИЕ ЛЕЙКОЦИТАРНЫХ ФИЛЬТРОВ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА НА ОСНОВЕ ЦИТОКИН-ИНДУЦИРОВАННЫХ КИЛЛЕРОВ

Резюме

Способность цитокин-индуцированных киллеров (ЦИК) распознавать и лизировать опухолевые клетки продемонстрирована в доклинических исследованиях in vitro. На портале ClinicalTrials.gov на данный момент зарегистрировано более 600 завершенных клинических исследований, посвященных методике клеточной иммунотерапии, из них более 30 применению ЦИК. Существует множество способов получения клеточных препаратов на основе лимфоцитов. Их общим недостатком, на наш взгляд, является необходимость дополнительных заборов крови для получения клеточного препарата в больших объемах, поэтому остается актуальным разрабатывать новые подходы с учетом решения данной проблемы. Была предложена идея извлечения лимфоцитов из лейкоцитарных фильтров с последующей активацией данных клеток в условиях in vitro.

Целью исследования являлась оценка возможности  применения лейкоцитарных фильтров в качестве источника лимфоцитов для получения больших доз клеток ЦИК.

Материалы и методы. В исследование включены данные 30 доноров. В статье подробно описана процедура извлечения лимфоцитов из лейкоцитарных фильтров. Выделенные лимфоциты культивировали в пластиковых флаконах в СО2-инкубаторе 10-14 суток в среде на основе RPMI-1640, в которую предварительно добавили IL-2 и IL-15. Оценку уровня активации клеток проводили методами иммуноферментного анализа (ИФА) и проточной цитометрии. Оценивали субпопуляционный состав Т-, NK-, TNK-, B-лимфоцитов (CD3, CD4, CD8, CD14, CD16, CD19, CD45, CD56) и маркеры активации на них (CD38 и HLA-DR) до и после активации клеток.

Результаты. Оценена возможность применения лейкоцитарных фильтров после сепарации плазмы с оставшимися на них лейкоцитами. Изучена функциональная активность извлеченных лимфоцитов и цитокиновый состав супернатантов после культивирования в полной питательной среде. Показано, что пептидный комплекс-супернатант содержал высокие дозы сигналинговых белков: IL-2, IL-6 IL-10, IFNγ, TNFα и сохранял свою функциональную активность после длительного хранения при низких температурах. Препарат является стерильным и состоит преимущественно из Т-, ТNK- и NK- клеток с высоким уровнем жизнеспособности и содержит маркеры активации: HLA-DR, CD38.

Заключение.  Таким образом, из одного фильтра получали до 350 млн активированных лимфоцитов и аликвоты с супернатантом. Препарат может применяться как для фундаментальных исследований, так и для проведения АИТ онкологическим больным с целью восстановления собственного потенциала противоопухолевого иммунитета пациентов. Данное количество клеточного и бесклеточного препарата является достаточным для проведения большего количества курсов АИТ без дополнительных заборов крови.

1. Абакушина Е.В., Гельм Ю.В., Пасова И.А., Бажин А.В. Иммунотерапевтические подходы к лечению больных колоректальным раком // Биохимия, 2019. Т. 84, № 7. С. 923-933. Abakushina E.V.,

2. Gelm Yu.V., Pasova I.A., Bazhin A.V. Immunotherapeutic approaches for the treatment of colorectal cancer.

3. Biokhimiya = Biochemistry, 2019, Vol. 84, no. 7, pp. 720-728. (In Russ.) doi: 10.1134/S0320972519070042

4. doi: 10.1134/S0006297919070046

5. Абакушина Е.В., Маризина Ю.В., Пасова И.А., Каприн А.Д., Неприна Г.С. Способ лечения онкологических больных цитотоксическими лимфоцитами. Патент RU 2596505 C1, 10.09.2016. Abakushina E.V., Marizina Yu.V., Pasova I.A., Kaprin A.D., Neprina G.S. A method for treating cancer patients with cytotoxic lymphocytes. Patent RU 2596505 C1, 10.09.2016. https://new.fips.ru/registers-doc-view/fips_servlet?DB=RUPAT&DocNumber=2596505&TypeFile=html

6. Гельм Ю.В., Абакушина Е.В., Пасова И.А., Гривцова Л.Ю. Разработка подходов к клеточной иммунотерапии онкологических больных // Медицинская иммунология, 2021. Т. 23, № 2. С. 381-388. Gelm Yu.V., Abakushina E.V., Pasova I.A., Grivtsova L.Yu. Development of approaches for cellular immunotherapy of cancer patients. Medical Immunology (Russia) doi: 10.15789/1563-0625-DOA-2135

7. Гельм Ю.В., Кузьмина Е.Г., Абакушина Е.В. Функциональная активность лимфоцитов здоровых доноров и онкологических больных при культивировании в присутствии ИЛ-2 и ИЛ-15 // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2019 г. Т. 167, № 4. С. 471-477. Gel’m Yu.V., Kuz’mina E.G., Abakushina E.V. Functional activity of lymphocytes of healthy donors and cancer patients after culturing with IL-2 and IL-15. Medicine and Biology Experimental of Bulletin. 2019. V. 167, №4. P. 486-491. https://www.elibrary.ru/item.asp?id=37196972

8. https://www.elibrary.ru/item.asp?id=43203784

9. Киселевский М.В., Анисимова Н.Ю., Соснов А.В. Способ получения активированных мононуклеарных лейкоцитов. Патент RU 2402338 C1, 27.10.2010. Kiselevsky M.V., Anisimova N.Yu.,

10. Sosnov A.V. Method for obtaining activated mononuclear leukocytes. Patent RU 2402338 C1, 10.27.2010 https://new.fips.ru/registers-doc-view/fips_servlet?DB=RUPAT&DocNumber=2402338&TypeFile=html

11. Мельникова В.Н., Селиванов Е.А., Кирьянова Г.Ю., Ефимова Т.А. Метод заготовки лейкофильтрованных отмытых эритроцитов // Трансфузиология, 2010. Т. 11, №3. С. 4-10. Melnikova V.N., Selivanov E.A., Kiryanova G.U., Efimova T.A. The method of preparation of leukodepleted washed red blood cells. Transfusiology. 2010. V. 11, №3. P. 4-11. https://www.elibrary.ru/item.asp?id=21654223

12. Национальная медицинская библиотека: официальный сайт правительства США, результаты поиска: клеточная иммунотерапия. [Электронный ресурс]. Режим доступа: https://clinicaltrials.gov/search?intr=cellular%20immunotherapy&aggFilters=status:com/ (дата обращения: 31.01.2025) NIH National Library of Medicine: official website of the USA government, Search Results: cellular immunotherapy. [Electronic resource]. Available at: https://clinicaltrials.gov/search?intr=cellular%20immunotherapy&aggFilters=status:com/ (access date: 31.01.2025) https://clinicaltrials.gov/search?intr=cellular%20immunotherapy&aggFilters=status:com

13. Национальная медицинская библиотека: официальный сайт правительства США, результаты поиска: ЦИК. [Электронный ресурс]. Режим доступа:https://clinicaltrials.gov/search?intr=CIK/ (дата обращения: 31.01.2025) NIH National Library of Medicine: official website of the USA government, Search Results: CIK. [Electronic resource]. Available at: https://clinicaltrials.gov/search?intr=CIK/ (access date: 31.01.2025) https://clinicaltrials.gov/search?intr=CIK

14. Одобренные продукты клеточной и генной терапии: официальный сайт правительства США. [Электронный ресурс]. Режим доступа:https://www.fda.gov/vaccines-blood-biologics/cellular-gene-therapy-products/approved-cellular-and-gene-therapy-products/ (дата обращения: 31.01.2025) Approved Cellular and Gene Therapy Products, FDA.gov: official website of the USA government. [Electronic resource]. Available at: https://www.fda.gov/vaccines-blood-biologics/cellular-gene-therapy-products/approved-cellular-and-gene-therapy-products/ (access date: 31.01.2025) https://www.fda.gov/vaccines-blood-biologics/cellular-gene-therapy-products/approved-cellular-and-gene-therapy-products

15. Свадовский А.И., Пушкина Е.А., Гультяев М.М. Способ лечения внутримозговой опухоли головного мозга. Патент RU 2201762 С1, 10.04.2003. Svadovsky A.I., Pushkina E.A., Gultyaev M.M. Method for treating intracerebral brain tumor. Patent RU 2201762 C1 04.10.2003. https://www.fips.ru/iiss/document.xhtml?faces-redirect=true&id=8e523719840251c989bdd8e7833a41c4

16. Чикилева И.О., Анисимова Н.Ю.,

17. Верескунова Н.В., Киселевский М.В. Способ получения активированных лейкоцитов для адъювантной адаптивной иммунотерапии злокачественных новообразований. Патент RU 2414915 C2, 27.03.2011. Chikileva I.O., Anisimova N.Yu.,

18. Vereskunova N.V., Kiselevsky M.V. Method for obtaining activated leukocytes for adjuvant adaptive immunotherapy of malignant neoplasms: Patent RU 2414915 C2, 03.27.2011. https://www.fips.ru/iiss/document.xhtml?faces-redirect=true&id=79b0e4aecda412639585e9a6ace29f58

19. Kim J.S., Kim Y.G., Pyo M., Lee H.K., Hong J.T., Kim Y., Han S.B. Adoptive cell therapy of melanoma with cytokine-induced killer cells. Immune Network. 2015. - 15(2), pp. 58-65. Kim J.S., Kim Y.G., Pyo M., Lee H.K., Hong J.T., Kim Y., Han S.B. Adoptive cell therapy of melanoma with cytokine-induced killer cells. Immune Network. 2015. - 15(2), pp. 58-65. doi: 10.4110/in.2015.15.2.58

20. Schmidt-Wolf I. G., Negrin R. S., Kiem H. P., Blume K. G., Weissman I. L. Use of a SCID mouse/human lymphoma model to evaluate cytokine-induced killer cells with potent antitumor cell activity. J. Exp. Med . 1991. - №174 (1), pp. 139–149. Schmidt-Wolf I. G., Negrin R. S., Kiem H. P., Blume K. G., Weissman I. L. Use of a SCID mouse/human lymphoma model to evaluate cytokine-induced killer cells with potent antitumor cell activity. J. Exp. Med . 1991. - №174 (1), pp. 139–149. doi: 10.1084/jem.174.1.139

21. Schmidt-Wolf I.G., Finke S., Trojaneck B., Denkena A., Lefterova P., Schwella N., Heuft H.G., Prange G., Korte M., Takeya M., Dorbic T., Neubauer A., Wittig B., Huhn D. Phase I clinical study applying autologous immunological effector cells transfected with the interleukin-2 gene in patients with metastatic renal cancer, colorectal cancer and lymphoma. Br. J. Cancer. 1999. -81, pp. 1009–1016. Schmidt-Wolf I.G., Finke S., Trojaneck B., Denkena A., Lefterova P., Schwella N., Heuft H.G., Prange G., Korte M., Takeya M., Dorbic T., Neubauer A., Wittig B., Huhn D.

22. Phase I clinical study applying autologous immunological effector cells transfected with the interleukin-2 gene in patients with metastatic renal cancer, colorectal cancer and lymphoma Br. J. Cancer. 1999. -81, pp. 1009–1016. doi: 10.1038/sj.bjc.6690800

23. Wang F. Sh., Liu M.X., Zhang B., Shi M., Lei Zh.Y., Sun W.B., Du Q.Y., Chen J.M. Antitumor activities of human autologous cytokine-induced killer (CIK) cells against hepatocellular carcinoma cells in vitro and in vivo. World J. Gastroenterol. 2002. - 8(3), pp. 464-468. Wang F.Sh., Liu M.X., Zhang B., Shi M., Lei Zh.Y., Sun W.B., Du Q.Y., Chen J.M. Antitumor activities of human autologous cytokine-induced killer (CIK) cells against hepatocellular carcinoma cells in vitro and in vivo. World J. Gastroenterol. 2002. - 8(3), pp. 464-468. doi: 10.3748/wjg.v8.i3.464