ОПЫТ РАЗРАБОТКИ И ПРИМЕНЕНИЯ МЕТОДА ИССЛЕДОВАНИЯ СПОСОБНОСТИ НЕЙТРОФИЛОВ К ФОРМИРОВАНИЮ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ ЛОВУШЕК

Резюме

Феномен образования нейтрофильных внеклеточных ловушек (НВЛ), или нетоз, играет ключевую роль в патогенезе инфекционных и воспалительных заболеваний. Однако отсутствие стандартизированных методов оценки НВЛ затрудняет корректную интерпретацию результатов. Цель исследования – разработать применимую на практике методику исследования способности нейтрофилов к формированию НВЛ, позволяющую корректно идентифицировать сопряженные с нетозом феномены.

Нейтрофилы выделяли из периферической крови 15 здоровых доноров методом градиентного центрифугирования (фиколл-верографин, градиент плотности 1,077 – 1,105 г/мл). Для стимуляции нетоза использовали смесь бактерий (Lactobacillus reuteri, L. acidophilus, L. rhamnosus, Bifidobacterium longum). Для визуализации НВЛ и других люминесцентно-позитивных объектов использовали интеркалирующий краситель пропидия йодид и антитела моноклональные мышиные к человеческим CD15/FITC. Люминесцентную микроскопию проводили при длине волны возбуждения 450-480 нм, эмиссии – от 515 нм. В препарате регистрировали интактные нейтрофилы (объекты ярко-зелёного цвета, без прокрашенного ядра), активированные нейтрофилы (ярко-зелёные с красно-оранжевым, окрашенным пропидия йодидом ядром), клетки раннего нетоза (ярко-зелёные клетки с выходом ядерного материала в одной или более локации за пределы клеточной мембраны), НВЛ: облаковидные (в виде «облака», окружающего нейтрофил или его фрагменты со всех сторон и более чем 1,5 раза больше его размера) и нитевидные (в виде нитей в 2 и более раза больше размера нейтрофила). Определяли долю каждого из типов наблюдаемых объектов относительно всех люминесцентно-позитивных объектов. В ходе оптимизации методики определены ключевые параметры: температура инкубации лейкоцитов со стимулятором (37°C), его концентрация (2,5х10⁹ бактерий/мл), время стимуляции (30 мин).

Оценка воспроизводимости метода показала приемлемый межсерийный коэффициент вариации: 13,8% для нитевидных и 15,2% для облаковидных НВЛ. Метод исследования был применен в различных группах пациентов, имеющих определенную инфекционную (туберкулез легких) и неинфекционную патологию (язвенный колит, аневризмальные костные кисты). Результаты оценки способности нейтрофилов к образованию НВЛ у представителей обследуемых когорт позволяют сделать вывод о достаточном уровне чувствительности и манифестности регистрируемых с помощью данной методики показателей.

1. Кассина Д.В., Василенко И.А., Гурьев А.С., Волков А.Ю., Метелин В.Б. Нейтрофильные внеклеточные ловушки: значение для диагностики и прогноза COVID-19 // Альманах клинической медицины. – 2020. – №48. – С. 43–50. Kassina D.V., Vasilenko I.A., Gur’ev A.S., Volkov A.Yu., Metelin V.B. Neutrophil extracellular traps: diagnostic and prognostic value in COVID-19. Almanac of clinical medicine, 2020, no. 48, pp. 43–50. DOI 10.18786/2072-0505-2020-48-029

2. Ливзан М.А., Бикбавова Г.Р., Новиков Д.Г., Золотов А.Н., Кириченко Н.А., Пахтусова П.О., Михалева Л.В. Оценка нетозобразующей способности нейтрофилов у пациентов с язвенным колитом // Медицинский алфавит. – 2023. – № 18. – С. 23-27. Livzan M.A., Bikbavova G.R., Novikov D.G., Zolotov A.N., Kirichenko N.A., Pakhtusova P.O., Mikhaleva L.V. Assessment of neutrophil nets-forming activity in patients with ulcerative colitis. Medical alphabet, 2023, no. 18, pp. 23-27. DOI 10.33667/2078-5631-2023-18-23-27

3. Мордык А.В., Золотов А.Н., Новиков Д.Г., Кириченко Н.А., Пахтусова П.О., Птухин А.О. Нетозформирующая способность нейтрофилов у пациентов с ограниченным и распространенным туберкулезным процессом // Туберкулез и болезни легких. – 2023. – Т. 101, № 3. – С. 78-86. Mordyk A.V., Zolotov A.N., Novikov D.G., Kirichenko N.A., Pakhtusova P.O., Ptukhin A.O. Netosis-forming ability of neutrophils in patients with limited and disseminated tuberculous lesions. Tuberculosis and lung diseases, 2023, Vol. 101, no. 3, pp. 78-86. DOI 10.58838/2075-1230-2023-101-3-78-86

4. Мордык А.В., Золотов А.Н., Новиков Д.Г., Романова М.А., Индутный А.В., Кириченко Н.А., Птухин А.О. Возрастные особенности формирования внеклеточных ловушек нейтрофилов у здоровых лиц и больных туберкулёзом // Вестник современной клинической медицины. – 2023. – Т. 16, № 6. – С. 37-45. Mordyk A.V., Zolotov A.N., Novikov D.G., Romanova M.A., Indutny A.V., Kirichenko N.A., Ptukhin A.O. Age-related differences of forming neutrophil extracellular traps in healthy individuals and in tuberculosis patients. The bulletin of contemporary clinical medicine, 2023, Vol. 16, no. 6. pp. 37-45. DOI 10.20969/VSKM.2023.16(6).37-45

5. Мордык А.В., Золотов А.Н., Новиков Д.Г., Романова М.А., Кириченко Н.А., Птухин А.О. Нетозобразующая способность нейтрофилов у детей с латентной туберкулезной инфекцией при положительной пробе с аллергеном туберкулезным рекомбинантным // Вопросы практической педиатрии. – 2023. – Т. 18, № 5. – С. 7–12. Mordyk A.V., Zolotov A.N., Novikov D.G., Romanova M.A., Kirichenko N.A., Ptukhin A.O. Netosis-forming ability of neutrophils in children with latent tuberculosis infection with the positive test with a tuberculosis recombinant allergen. Clinical practice in pediatrics, 2023, Vol. 18, no. 5, pp. 7-12. DOI 10.20953/1817-7646-2023-5-7-12

6. Мордык А.В., Новиков Д.Г., Золотов А.Н., Романова М.А., Кириченко Н.А., Птухин А.О., Самусева Н.Л. Способность нейтрофилов к формированию внеклеточных ловушек у детей с первичным туберкулезным комплексом и туберкулезом внутригрудных лимфатических узлов. // Вопросы практической педиатрии. – 2024. – Т. 19, № 5. – С. 46–53. Mordyk A.V., Novikov D.G., Zolotov A.N., Romanova M.A., Kirichenko N.A., Ptukhin A.O., Samuseva N.L. Ability of neutrophils to form extracellular traps in children with primary tuberculosis complex and intrathoracic lymph node tuberculosis. Clinical practice in pediatrics, 2024, Vol. 19, no. 5, pp. 46-53. DOI 10.20953/1817-7646-2024-5-46-53

7. Насонов Е.Л., Авдеева А.С., Решетняк Т.М., Алексанкин А.П., Рубцов Ю.П. Роль нетоза в патогенезе иммуновоспалительных ревматических заболеваний // Научно-практическая ревматология. – 2023. – Т. 61, №5. – С. 513-530. Nasonov E.L., Avdeeva A.S., Reshetnyak T.M., Aleksankin A.P., Rubtsov Yu.P. The role of NETosis in the pathogenesis of immunoinflammatory rheumatic diseases. Rheumatology Science and Practice, 2023, Vol. 61, no. 5, pp. 513-530. DOI 10.47360/1995-4484-2023-513-530

8. Новиков Д.Г., Золотов А.Н., Индутный А.В., Мордык А.В., Кириченко Н.А., Романова М.А., Птухин А.О. Характеристика продукции нейтрофильных внеклеточных ловушек и концентрации цитруллинированного гистона H3 у детей, больных туберкулезом. // Бюллетень сибирской медицины. –2024. – Т. 23, № 4. – С. 95-104. Novikov D.G., Zolotov A.N., Indutny A.V., Mordyk A.V., Kirichenko N.A., Romanova M.A., Ptukhin A.O. NETs production and citrullinated histone H3 level in children with tuberculosis. Bulletin of Siberian medicine, 2024, Vol. 23, no. 4, pp. 95-104. DOI 10.20538/1682-0363-2024-4-95-104

9. Brinkmann V, Reichard U, Goosmann C, Fauler B, Uhlemann Y, Weiss DS, Weinrauch Y, Zychlinsky A. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science, 2004, Vol. 303, no. 5663, pp. 1532-1535. – DOI 10.1126/science.1092385

10. Inozemtsev V, Sergunova V, Vorobjeva N, Kozlova E, Sherstyukova E, Lyapunova S, Chernysh A. Stages of NETosis Development upon Stimulation of Neutrophils with Activators of Different Types. Int J Mol Sci, 2023, Vol. 24, no. 15, pp. 12355. – DOI 10.3390/ijms241512355

11. Konig MF, Andrade F. A Critical Reappraisal of Neutrophil Extracellular Traps and NETosis Mimics Based on Differential Requirements for Protein Citrullination. Front Immunol., 2016, Vol. 7, pp. 461. – DOI 10.3389/fimmu.2016.00461

12. Oh H, Siano B, Diamond S. Neutrophil isolation protocol. J Vis Exp., 2008, no. 17. pp. 745. – DOI 10.3791/745

13. Pisklakov A.V., Novikov D.G., Zolotov A.N., Palianov K.V., Korobeinikov M.M., Ponomarev V.I., Kalinichev A.G., Lysov A.V. Netosis as a process involved in the consolidation of aneurysmal bone cysts in children using hemostatic agents. Medical News of North Caucasus, 2024, Vol. 19, no. 2, pp. 111-116. – DOI 10.14300/mnnc.2024.19025

14. Sergunova V, Inozemtsev V, Vorobjeva N, Kozlova E, Sherstyukova E, Lyapunova S, Chernysh A. Morphology of Neutrophils during Their Activation and NETosis: Atomic Force Microscopy Study. Cells, 2023, Vol. 12, no. 17, pp. 2199. – DOI 10.3390/cells12172199

15. Stoimenou M, Tzoros G, Skendros P, Chrysanthopoulou A. Methods for the Assessment of NET Formation: From Neutrophil Biology to Translational Research. Int J Mol Sci., 2022, Vol. 23, no. 24. pp. 15823. – DOI 10.3390/ijms232415823

16. Yousefi S, Simon HU. NETosis - Does It Really Represent Nature's "Suicide Bomber"? Front Immunol., 2016, Vol. 7, pp. 328. – DOI 10.3389/fimmu.2016.00328