Опыт разработки и применения метода исследования способности нейтрофилов к формированию внеклеточных ловушек

Феномен образования нейтрофильных внеклеточных ловушек (НВЛ), или нетоз, играет ключевую роль в патогенезе инфекционных и воспалительных заболеваний. Однако отсутствие стандартизированных методов оценки НВЛ затрудняет корректную интерпретацию результатов. Цель исследования – разработать применимую на практике методику исследования способности нейтрофилов к формированию НВЛ, позволяющую корректно идентифицировать сопряженные с нетозом феномены. Нейтрофилы выделяли из периферической крови 15 здоровых доноров методом градиентного центрифугирования (фиколл-верографин, градиент плотности 1,077-1,105 г/мл). Для стимуляции нетоза использовали смесь бактерий (Lactobacillus reuteri, L. acidophilus, L. rhamnosus, Bifidobacterium longum). Для визуализации НВЛ и других люминесцентно-позитивных объектов использовали интеркалирующий краситель пропидия йодид и антитела моноклональные мышиные к человеческим CD15/FITC. Люминесцентную микроскопию проводили при длине волны возбуждения 450-480 нм, эмиссии – от 515 нм. В препарате регистрировали интактные нейтрофилы (объекты ярко-зеленого цвета, без прокрашенного ядра), активированные нейтрофилы (ярко-зеленые с красно-оранжевым, окрашенным пропидия йодидом ядром), клетки раннего нетоза (ярко-зеленые клетки с выходом ядерного материала в одной или более локации за пределы клеточной мембраны), НВЛ: облаковидные (в виде «облака», окружающего нейтрофил или его фрагменты со всех сторон и более чем 1,5 раза больше его размера) и нитевидные (в виде нитей в 2 и более раза больше размера нейтрофила). Определяли долю каждого из типов наблюдаемых объектов относительно всех люминесцентно-позитивных объектов. В ходе оптимизации методики определены ключевые параметры: температура инкубации лейкоцитов со стимулятором (37 °C), его концентрация (2,5 × 10⁹ бактерий/мл), время стимуляции (30 мин). Оценка воспроизводимости метода показала приемлемый межсерийный коэффициент вариации: 13,8% для нитевидных и 15,2% для облаковидных НВЛ. Метод исследования был применен в различных группах пациентов, имеющих определенную инфекционную (туберкулез легких) и неинфекционную патологию (язвенный колит, аневризмальные костные кисты). Результаты оценки способности нейтрофилов к образованию НВЛ у представителей обследуемых когорт позволяют сделать вывод о достаточном уровне чувствительности и манифестности регистрируемых с помощью данной методики показателей.

1. Кассина Д.В., Василенко И.А., Гурьев А.С., Волков А.Ю., Метелин В.Б. Нейтрофильные внеклеточные ловушки: значение для диагностики и прогноза COVID-19 // Альманах клинической медицины, 2020. № 48 (S1). С. S43-S50.

2. Ливзан М.А., Бикбавова Г.Р., Новиков Д.Г., Золотов А.Н., Кириченко Н.А., Пахтусова П.О., Михалева Л.В. Оценка нетозобразующей способности нейтрофилов у пациентов с язвенным колитом // Медицинский алфавит, 2023. № 18. С. 23-27.

3. Мордык А.В., Золотов А.Н., Новиков Д.Г., Кириченко Н.А., Пахтусова П.О., Птухин А.О. Нетозформирующая способность нейтрофилов у пациентов с ограниченным и распространенным туберкулезным процессом // Туберкулез и болезни легких, 2023. Т. 101, № 3. С. 78-86.

4. Мордык А.В., Золотов А.Н., Новиков Д.Г., Романова М.А., Индутный А.В., Кириченко Н.А., Птухин А.О. Возрастные особенности формирования внеклеточных ловушек нейтрофилов у здоровых лиц и больных туберкулёзом // Вестник современной клинической медицины, 2023. Т. 16, № 6. С. 37-45.

5. Мордык А.В., Золотов А.Н., Новиков Д.Г., Романова М.А., Кириченко Н.А., Птухин А.О. Нетозобразующая способность нейтрофилов у детей с латентной туберкулезной инфекцией при положительной пробе с аллергеном туберкулезным рекомбинантным // Вопросы практической педиатрии, 2023. Т. 18, № 5. С. 7-12.

6. Мордык А.В., Новиков Д.Г., Золотов А.Н., Романова М.А., Кириченко Н.А., Птухин А.О., Самусева Н.Л. Способность нейтрофилов к формированию внеклеточных ловушек у детей с первичным туберкулезным комплексом и туберкулезом внутригрудных лимфатических узлов // Вопросы практической педиатрии, 2024. Т. 19, № 5. С. 46-53.

7. Насонов Е.Л., Авдеева А.С., Решетняк Т.М., Алексанкин А.П., Рубцов Ю.П. Роль нетоза в патогенезе иммуновоспалительных ревматических заболеваний // Научно-практическая ревматология, 2023. Т. 61, № 5. С. 513-530.

8. Новиков Д.Г., Золотов А.Н., Индутный А.В., Мордык А.В., Кириченко Н.А., Романова М.А., Птухин А.О. Характеристика продукции нейтрофильных внеклеточных ловушек и концентрации цитруллинированного гистона H3 у детей, больных туберкулезом // Бюллетень сибирской медицины, 2024. Т. 23, № 4. С. 95-104.

9. Brinkmann V., Reichard U., Goosmann C., Fauler B., Uhlemann Y., Weiss D.S., Weinrauch Y., Zychlinsky A. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science, 2004, Vol. 303, no. 5663, pp. 1532-1535.

10. Inozemtsev V., Sergunova V., Vorobjeva N., Kozlova E., Sherstyukova E., Lyapunova S., Chernysh A. Stages of NETosis Development upon Stimulation of Neutrophils with Activators of Different Types. Int. J. Mol. Sci., 2023, Vol. 24, no. 15, 12355. doi: 10.3390/ijms241512355.

11. Konig M.F., Andrade F. A critical reappraisal of neutrophil extracellular traps and NETosis mimics based on differential requirements for protein citrullination. Front. Immunol., 2016, Vol. 7, 461. doi: 10.3389/fimmu.2016.00461.

12. Oh H., Siano B., Diamond S. Neutrophil isolation protocol. J. Vis. Exp., 2008, no. 17, 745. doi: 10.3791/745.

13. Pisklakov A.V., Novikov D.G., Zolotov A.N., Palianov K.V., Korobeinikov M.M., Ponomarev V.I., Kalinichev A.G., Lysov A.V. Netosis as a process involved in the consolidation of aneurysmal bone cysts in children using hemostatic agents. Medical News of North Caucasus, 2024, Vol. 19, no. 2, pp. 111-116.

14. Sergunova V., Inozemtsev V., Vorobjeva N., Kozlova E., Sherstyukova E., Lyapunova S., Chernysh A. Morphology of Neutrophils during Their Activation and NETosis: Atomic Force Microscopy Study. Cells, 2023, Vol. 12, no. 17, 2199. doi: 10.3390/cells12172199.

15. Stoimenou M., Tzoros G., Skendros P., Chrysanthopoulou A. Methods for the Assessment of NET Formation: From Neutrophil Biology to Translational Research. Int. J. Mol. Sci., 2022, Vol. 23, no. 24, 15823. doi: 10.3390/ijms232415823.

16. Yousefi S., Simon H.U. NETosis – Does It Really Represent Nature’s “Suicide Bomber”? Front. Immunol., 2016, Vol. 7, 328. doi: 10.3389/fimmu.2016.00328.