Ранние маркеры гемопоэтической дифференцировки индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека

Генерация иммунокомпетентных клеток из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток является ценной моделью для изучения механизмов регуляции гемопоэза и перспективным подходом к разработке новых методов иммунотерапии различных заболеваний, включая наследственные, онкологические и инфекционные. К настоящему времени показана возможность получения из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека различных клеток иммунной системы, в том числе макрофагов, нейтрофилов, естественных киллеров и Т-лимфоцитов. Однако предложенные протоколы носят в основном экспериментальный характер и для дальнейшего применения требуют оптимизации, стандартизации и масштабирования. Решение этих задач, в свою очередь, требует наличия методов ранней оценки эффективности проводимой дифференцировки. В настоящей работе оценивали возможность использования проточной цитометрии для мониторинга эффективности ранних этапов гемопоэтической дифференцировки индуцированных плюрипотентных стволовых клеток. Гемопоэтическую и миелоидную дифференцировку индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека проводили с использованием двух протоколов, предложенных ранее для генерации макрофагов из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток. Использованные протоколы различались по условиям проведения ранних и поздних стадий дифференцировки. Ранние этапы дифференцировки различались по способу индукции образования мезодермальных клеток и гемогенного эндотелия: дифференцировка в условиях 2D с добавлением экзогенных факторов, стимулирующих мезодермальное направление дифференцировки («фактор-зависимый» протокол) или в условиях 3D без добавления экзогенных факторов («спонтанный» протокол). На более поздних стадиях протоколы различались по набору экзогенных факторов, использующихся для индукции гемопоэтической и миелоидной спецификации (SCF, FGF2, IL-6, IL-3 и M-CSF или только IL-3 и M-CSF). В процессе дифференцировки с использованием обоих протоколов проводили анализ экспрессии маркеров мезодермы, гемогенного эндотелия и гемопоэтических клеток (CD309, CD34, CD31, CD43 и CD45). На начальных стадиях дифференцировки основным фенотипическим изменением было появление экспрессии на клетках рецептора к фактору роста эндотелия сосудов CD309, экспрессии сиалофорина CD43, а также антигена CD34. При использовании фактор-зависимого 2D-протокола эти изменения фиксировались раньше и были более выраженными, чем при использовании протокола, основанного на спонтанной дифференцировке клеток в условиях 3D. Полученные результаты позволяют заключить, что определение экспрессии CD309 и/или CD43 может быть использовано для ранней предикции успешности дифференцировки иПСК в гемопоэтическом направлении.

1. Garcia-Alegria E., Menegatti S., Fadlullah M.Z.H., Menendez P., Lacaud G., Kouskoff V. Early human hemogenic endothelium generates primitive and definitive hematopoiesis in vitro. Stem Cell Rep., 2018, Vol. 11, no. 5, pp. 1061-1074.

2. Goldenson B.H., Hor P., Kaufman D.S. iPSC-derived natural killer cell therapies – expansion and targeting. Front. Immunol., 2022, Vol. 13, 841107. doi: 10.3389/fimmu.2022.841107.

3. Hu Y., Li Y., Yao Z., Huang F., Cai H., Liu H., Zhang X., Zhang J. Immunotherapy: review of the existing evidence and challenges in breast cancer. Cancers (Basel). 2023, Vol. 15, no. 3, 563. doi: 10.3390/cancers15030563.

4. Klepikova A., Nenasheva T., Sheveleva O., Protasova E., Antonov D., Gainullina A., Chikina E., Sakovnich O., Gerasimova T., Nikitina I., Shevalie D., Lyadova I. iPSC-derived macrophages: the differentiation protocol affects cell immune characteristics and differentiation trajectories. Int. J. Mol. Sci., 2022, Vol. 23, no. 24, 16087. doi: 10.3390/ijms232416087.

5. Lange L., Morgan M., Schambach A. The hemogenic endothelium: a critical source for the generation of PSC-derived hematopoietic stem and progenitor cells. Cell. Mol. Life Sci., 2021,Vol. 78, no. 9, pp. 4143-4160.

6. Lyadova I., Gerasimova T., Nenasheva T. Macrophages derived from human induced pluripotent stem cells: The diversity of protocols, future prospects, and outstanding questions. Front. Cell Dev. Biol., 2021, Vol. 9, 640703. doi: 10.3389/fcell.2021.640703.

7. Lyadova I., Vasiliev A. Macrophages derived from pluripotent stem cells: Prospective applications and research gaps. Cell Biosci., 2022, Vol. 12, 96. doi: 10.1186/s13578-022-00824-4.

8. Malakhova A.A., Grigor’eva E.V., Pavlova S.V., Malankhanova T.B., Valetdinova K.R., Vyatkin Y.V., Khabarova E.A., Rzaev J.A., Zakian S.M., Medvedev S.P. Generation of induced pluripotent stem cell lines ICGi021-A and ICGi022-A from peripheral blood mononuclear cells of two healthy individuals from Siberian population. Stem Cell Res., 2020, Vol. 48, 101952. doi: 10.1016/j.scr.2020.101952.

9. Miyauchi M., Ito Y., Nakahara F., Hino T., Nakamura F., Iwasaki Y., Kawagoshi T., Koya J., Yoshimi A., Arai S., Kagoya Y., Kurokawa M. Efficient production of human neutrophils from iPSCs that prevent murine lethal infection with immune cell recruitment. Blood, 2021, Vol. 138, no. 24, p. 2555-2569.

10. Sheveleva O., Protasova E., Nenasheva T., Butorina N., Melnikova V., Gerasimova T., Sakovnich O., Kurinov A., Grigor’eva E., Medvedev S., Lyadova I. A model of iPSC-derived macrophages with TNFAIP3 overexpression reveals the peculiarities of TNFAIP3 protein expression and function in human macrophages. Int. J. Mol. Sci., 2023, Vol. 24, no. 16, 12868 . doi: 10.3390/ijms241612868.

11. Takata K., Kozaki T., Lee C., Thion M.S., Otsuka M., Lim S., Utami K.H., Fidan K., Park D.S., Malleret B., Chakarov S., See P., Low D., Low G., Garcia-Miralles M., Zeng R., Zhang J., Goh C., Gul A., Hubert S., Lee B., Chen J., Low I., Shadan N-B., Lum J., Wei T-S., Mok E., Kawanishi S., Kitamura Y., Larbi A., Poidinger M., Renia L., Ng L-G., Wolf Y., Jung S., Önder T., Newell I., Huber T., Ashihara E., Garel S., Pouladi M., Ginhoux F. Induced-pluripotent-stem-cell-derived primitive macrophages provide a platform for modeling tissue-resident macrophage differentiation and function. Immunity, 2017, Vol. 47, pp. 183-198.

12. Trump L.R., Nayak R.C., Singh A.K., Emberesh S., Wellendorf A.M., Lutzko C.M., Cancelas J.A. Neutrophils derived from genetically modified human induced pluripotent stem cells circulate and phagocytose bacteria in vivo. Stem Cells Transl. Med., 2019, Vol. 8, no. 6, pp. 557-567.

13. Wallis R.S., O’Garra A., Sher A., Wack A. Host-directed immunotherapy of viral and bacterial infections: past, present and future. Nat. Rev. Immunol., 2023, Vol. 23, no. 2, pp. 121-133.

14. van Wilgenburg B., Browne C., Vowles J., Cowley S.A. Efficient, long term production of monocyte-derived macrophages from human pluripotent stem cells under partly-defined and fully-defined conditions. PLoS One, 2013, Vol. 8, e71098. doi: 10.1371/journal.pone.0071098.