Влияние многоэтапной изоляции нейтрофилов на их количество и жизнеспособность

Несмотря на множество разнообразных методов выделения нейтрофилов из периферической крови, сохраняется актуальной проблема получения достаточного количества жизнеспособной клеточной популяции высокой степени чистоты для количественного определения нейтрофильных цитокинов и экспрессии их мРНК. Рекомендуемые многоэтапные способы очистки нейтрофилов значительно увеличивают по времени продолжительность процесса выделения, могут приводить к активации или апоптозу клеток и сопровождаются их значительными потерями. Наиболее критичным по продолжительности и количеству дополнительных разнообразных манипуляций с клетками является этап предварительной очистки нейтрофилов. В связи с этим актуальным вопросом является сравнение различных методов предварительной изоляции нейтрофилов и выбор наиболее оптимального из них для получения достаточного количества жизнеспособных периферических нейтрофилов, что и явилось целью данной работы. Нами были изучены особенности влияния трех различных протоколов предварительного выделения клеточной взвеси (центрифугирование цельной крови на одинарном градиенте плотности с последующим осаждением эритроцитов декстраном; центрифугирование цельной крови на двойном градиенте плотности; быстрое выделение лейкоцитов с использованием реагента, способствующего агрегации эритроцитов) на количество и жизнеспособность нейтрофилов, очищенных на заключительном этапе с использованием негативной иммуномагнитной селекции. Установлено, что процедура предварительного выделения нейтрофилов для последующей иммуномагнитной изоляции влияет на их количество и жизнеспособность: максимальное количество жизнеспособных нейтрофилов получается при их выделении традиционным методом центрифугирования крови на градиенте плотности с последующим осаждением эритроцитов декстраном. В то же время исследуемые нами три разных метода предварительного выделения нейтрофилов не показали статистически значимых различий по количественному выходу жизнеспособных клеток после иммуномагнитной изоляции, что предполагает использование любого из этих методов в зависимости от возможностей и предпочтений исследователей. В целом наша работа подтверждает данные литературы о том, что многоступенчатый процесс изоляции нейтрофилов позволяет получить клеточную взвесь высокой степени чистоты (> 99,1%), которую можно использовать в дальнейшем для исследования их цитокин-секретирующей активности. Однако такая многоступенчатая изоляция значительно снижает количество нейтрофилов, что может быть критичным при исходно малых объемах крови.

1. Долгушин И.И., Рыжкова А.И., Савочкина А.Ю., Шишкова Ю.С. Способ выделения нейтрофильных гранулоцитов из периферической крови. Патент RU 2431836 С1, 20.10.2011.

2. Ковальчук Л.В. Иммунология. Практикум / Под ред. Л.В. Ковальчука, Г.А. Игнатьевой, Л.В. Ганковской. М.: ГЭОТАР-Медиа, 2010. 176 с.

3. Мамус М.А., Тихомирова Е.А., Трофименко А.С., Бедина С.А., Мозговая Е.Э., Спицина С.С., Зборовская И.А. Способ выделения нейтрофильных гранулоцитов из крови с использованием двухступенчатого градиента плотности йогексола. Патент RU 2739324 C1, 22.12.2020.

4. Arruda-Silva F., Bianchetto-Aguilera F., Gasperini S., Polletti S., Cosentino E., Tamassia N., Cassatella M.A. Human neutrophils produce CCL23 in response to various TLR-agonists and TNFalpha. Front. Cell. Infect. Microbiol., 2017, Vol. 7, 176. doi: 10.3389/fcimb.2017.00176.

5. Berends C., Dijkhuizen B., de Monchy J.G., Gerritsen J., Kauffman H.F. Induction of low density and upregulation of CD11b expression of neutrophils and eosinophils by dextran sedimentation and centrifugation. J. Immunol. Methods, 1994, Vol. 167, no 1-2, pp. 183-193.

6. Blanter M., Cambier S., De Bondt M., Vanbrabant L., Pörtner N., Salama S.A., Metzemaekers M., Marques P.E., Struyf S., Proost P., Gouwy M. Method matters: effect of purification technology on neutrophil phenotype and function. Front. Immunol., 2022, Vol. 13, 820058. doi: 10.3389/fimmu.2022.820058.

7. Blanter M., Gouwy M., Struyf S. Studying neutrophil function in vitro: cell models and environmental factors. J. Inflamm. Res., 2021, Vol. 14, pp. 141-162.

8. Borregaard N., Cowland J.B. Granules of the human neutrophilic polymorphonuclear leukocyte. Blood, 1997, Vol.89, no 10, pp. 3503-3521.

9. Borregaard N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity, 2010, Vol. 33, no. 5, pp. 657-670.

10. Boyum A. Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood: isolation of mononuclear cells by one centrifugation, and of granulocytes by combining centrifugation and sedimentation at 1 g. Scand. J. Clin. Lab. Invest., 1968, Suppl. 97, pp. 77-89.

11. Burn G.L., Foti A., Marsman G., Patel D.F., Zychlinsky A. The Neutrophil. Immunity, 2021, Vol. 54, Iss. 7, pp. 1377-1391.

12. Calzetti F., Tamassia N., Arruda-Silva F., Polletti S., Cosentino E., Tamassia N., Cassatella M.A. The importance of being “pure” neutrophils. J. Allergy Clin. Immunol., 2017, Vol. 139, pp. 352-355.

13. Cassatella M.A., Östberg N.K, Tamassia N., Soehnlein O. Biological Roles of Neutrophil-Derived Granule Proteins and Cytokines. Trends Immunol., 2019, Vol. 40, no. 7, pp. 648-664.

14. Connelly A.N., Huijbregts R.P.H., Pal H.C., Kuznetsova V., Davis M.D., Ong K.L., Fay C.X., Greene M.E., Overton E.T., Hel Z. Optimization of methods for the accurate characterization of whole blood neutrophils. Sci. Rep., 2022, Vol. 12, 3667. doi: 10.1038/s41598-022-07455-2.

15. Degel J., Shokrani M. Validation of the efficacy of a practical method for neutrophils isolation from peripheral blood. Clin. Lab. Sci., 2010, Vol. 23, pp. 94-98.

16. Ferrante A., Thong Y.H. Optimal conditions for simultaneous purification of mononuclear and polymorphonuclear leucocytes from human blood by the Hypaque-Ficoll method. J. Immunol. Methods, 1980, Vol. 36, no 2, pp. 109-117.

17. Ganesh K., Joshi M.B. Neutrophil sub-types in maintaining immune homeostasis during steady state, infections and sterile inflammation. Inflamm. Res., 2023, Vol. 72, pp. 1175-1192.

18. Giudicelli J., Philip P.J.M., Delque P., Sudaka P. A single-step centrifugation method for separation of granulocytes and mononuclear cells from blood using discontinuous density gradient of percoll. J. Immunol. Methods, 1982, Vol. 54, pp. 43-46.

19. Handrigan M.T., Burns A.R., Donnachie E.M., Bowden R.A. Hydroxyethyl starch inhibits neutrophil adhesion and transendothelial migration. Shock, 2005, Vol. 24, no. 5, pp. 434-439.

20. Hsu A.Y., Peng Z., Luo H., Loison F. Isolation of Human Neutrophils from Whole Blood and Buffy Coats. J. Vis. Exp., 2021, Vol. 175, e62837. doi: 10.3791/62837.

21. Hundhammer T., Gruber M., Wittmann S. Paralytic impact of centrifugation on human neutrophils. Biomedicines., 2022, Vol. 10, no. 11, 2896. doi: 10.3390/biomedicines10112896.

22. Jackson M.H., Millar A.M., Dawes J., Bell D. Neutrophil activation during cell separation procedures. Nucl. Med. Commun., 1989, Vol. 10, no. 12, pp. 901-904.

23. Kolářová H., Víteček J., Černá A., Černík M., Přibyl J., Skládal P., Potěšil D., Ihnatová I., Zdráhal Z., Hampl A., Klinke A., Kubala L. Myeloperoxidase mediated alteration of endothelial function is dependent on its cationic charge. Free Radic. Biol. Med., 2020, Vol. 162, pp. 14-26.

24. Krabbe J., Beilmann V., Alamzad-Krabbe H., Böll S., Seifert A., Ruske N., Kraus T., Martin C. Blood collection technique, anticoagulants and storing temperature have minor effects on the isolation of polymorphonuclear neutrophils. Sci. Rep., 2020, Vol. 10, no. 1, 14646. doi: 10.1038/s41598-020-71500-1.

25. Kremer V., Godon O., Bruhns P., Jönsson F., de Chaisemartin L. Isolation methods determine human neutrophil responses after stimulation. Front. Immunol., 2023, Vol. 14, 1301183. doi: 10.3389/fimmu.2023.1301183.

26. Kremserova S., Nauseef W.M. Isolation of human neutrophils from venous blood. Methods Mol. Biol., 2020, Vol. 2087, pp. 33-42.

27. Kuhns D.B., Priel D.A.L., Chu J., Zarember K.A. Isolation and functional analysis of human neutrophils. Curr. Protoc. Immunol., 2015, Vol. 111, pp. 7.23.1-7.23.16.

28. Liew P.X., Kubes P. The neutrophil’s role during health and disease. Physiol. Rev., 2019, Vol. 99, no. 2, pp. 1223-1248.

29. Mantovani A., Cassatella M.A., Costantini C., Jaillon S. Neutrophils in the activation and regulation of innate and adaptive immunity. Nat. Rev. Immunol., 2011, Vol. 11, no. 8, pp. 519-531.

30. Mayadas T.N., Cullere X., Lowell C.A. The multifaceted functions of neutrophils. Annu. Rev. Pathol., 2014, Vol. 9, pp. 181-218.

31. Mócsai A. Diverse novel functions of neutrophils in immunity, inflammation, and beyond. J. Exp. Med., 2013, Vol. 210, no. 7, pp. 1283-1299.

32. Nathan C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nat. Rev. Immunol., 2006, Vol. 6, no. 3, pp. 173-182.

33. Nauseef W.M. Neutrophils, from cradle to grave and beyond. Immunol. Rev. 2016, Vol. 273, no. 1, pp. 5-10.

34. Nauseef W., Borregaard N. Neutrophils at work. Nat. Immunol., 2014, Vol. 15, pp. 602-611.

35. Oh H., Siano B., Diamond S. Neutrophil isolation protocol. J. Vis. Exp., 2008, Vol. 17, 745. doi: 10.3791/745.

36. Quach A., Ferrante A. The application of dextran sedimentation as an initial step in neutrophil purification promotes their stimulation, due to the presence of monocytes. J. Immunol. Res., 2017, Vol. 2017, 1254792. doi: 10.1155/2017/1254792.

37. Rahman A.H., Tordesillas L., Berin M.C. Heparin reduces nonspecific eosinophil staining artifacts in mass cytometry experiments. Cytometry A, 2016, Vol. 89, pp. 601-607.

38. Scapini P., Calzetti F., Cassatella M.A. On the detection of neutrophil-derived vascular endothelial growth factor (VEGF). J. Immunol. Methods, 1999, Vol. 232, pp. 121-129.

39. Scapini P., Laudanna C., Pinardi C., Allavena P., Mantovani A., Sozzani S., Cassatella M.A. Neutrophils produce biologically active macrophage inflammatory protein-3alpha (MIP-3alpha)/CCL20 and MIP-3beta/CCL19. Eur. J. Immunol., 2001, Vol. 31, pp. 1981-1988.

40. Scapini P., Nardelli B., Nadali G., Calzetti F., Pizzolo G., Montecucco C., Cassatella M.A. G-CSF-stimulated neutrophils are a prominent source of functional BLyS. J. Exp. Med., 2003, Vol. 197, pp. 297-302.

41. Selsted M.E., Harwig S.S., Ganz T., Schilling J.W., Lehrer R.I. Primary structures of three human neutrophil defensins. J. Clin. Invest., 1985, Vol. 76, pp. 1436-1439.

42. Summers C., Rankin S.M., Condliffe A.M., Singh N., Peters A.M., Chilvers E.R. Neutrophil kinetics in health and disease. Trends Immunol., 2010, Vol. 31, no. 8, pp. 318-324.

43. Tamassia N., Bianchetto-Aguilera F., Arruda-Silva F., Gardiman E., Gasperini S., Calzetti F., Cassatella M.A. Cytokine production by human neutrophils: Revisiting the “dark side of the moon”. Eur. J. Clin. Invest., 2018, Vol. 48, Suppl. 2, e12952. doi: 10.1111/eci.12952.

44. Tamassia N., Cassatella M.A., Bazzoni F. Fast and accurate quantitative analysis of cytokine gene expression in human neutrophils. Methods Mol. Biol., 2014, Vol. 1124, pp. 451-467.

45. Tamassia N., Zimmermann M., Castellucci M., Ostuni R., Bruderek K., Schilling B., Brandau S., Bazzoni F., Natoli G., Cassatella M.A. Cutting edge: an inactive chromatin configuration at the IL-10 locus in human neutrophils. J. Immunol., 2013, Vol. 190, pp. 1921-1925.

46. Tecchio C., Micheletti A., Cassatella M.A. Neutrophil-derived cytokines: facts beyond expression. Front. Immunol., 2014, Vol. 5, 508. doi: 10.3389/fimmu.2014.00508.

47. Thomas H.B., Moots R.J., Edwards S.W., Wright H.L. Whose gene is it anyway? The effect of preparation purity on neutrophil transcriptome studies. PLoS ONE, 2015, Vol. 10, no. 9, e0138982. doi: 10.1371/journal.pone.0138982.

48. Trentini A., Murganti F., Rosta V., Cervellati C., Manfrinato M.C., Spadaro S., Dallocchio F., Volta C.A., Bellini T. Hydroxyethyl Starch 130/0.4 Binds to neutrophils impairing their chemotaxis through a mac-1 dependent interaction. Int. J. Mol. Sci., 2019, Vol. 20, no. 4, 817. doi: 10.3390/ijms20040817.

49. Watson F., Robinson J.J., Edwards S.W. Neutrophil function in whole blood and after purification: changes in receptor expression, oxidase activity and responsiveness to cytokines. Biosci. Rep., 1992, Vol. 12, no 2, pp. 123-133.

50. Zimmermann M., Aguilera F.B., Castellucci M., Rossato M., Costa S., Lunardi C., Ostuni R., Girolomoni G., Natoli G., Bazzoni F., Tamassia N., Cassatella M.A. Chromatin remodelling and autocrine TNFalpha are required for optimal interleukin-6 expression in activated human neutrophils. Nat. Commun., 2015, Vol. 6, 6061. doi: 10.1038/ncomms7061.