Определение и имунофенотипирование тромбоцитарно-моноцитарных комплексов в периферической крови с помощью проточной цитофлуорометрии

Активированные тромбоциты образуют комплексы с циркулирующими лейкоцитами посредством мембраносвязанных молекул. Взаимодействие тромбоцитов с моноцитами лежат в основе патофизиологических механизмов, связывающих процессы тромбообразования и воспаления. Определение и анализ тромбоцитарно-моноцитарных комплексов (ТМК) позволяет выявить их физиологическую и патогенетическую роль, а также имеет важное диагностическое значение при изучении различных патологических состояний, в том числе, акушерских. Цель исследования состояла в разработке метода определения количественного содержания ТМК в периферической крови, позволяющего сохранить основные фенотипические характеристики тромбоцитов и моноцитов, и выявить их изменения при анализе биоматериала ex vivo. Предлагаемый метод сочетает в себе немедленную фиксацию образцов крови, иммуноцитохимическое флуоресцентное окрашивание дифференцировочных и активационных маркеров тромбоцитов и моноцитов с последующим лизисом эритроцитов и анализ с помощью проточной цитофлуориметрии. Было исследовано 14 образцов периферической крови, полученных от пациенток с отягощенным акушерским анамнезом, в первом триместре текущей беременности. Показано, что процедура фиксации позволяет сохранить количественные и качественные характеристики ТМК, существующие in vivo, тогда как при отсутствии фиксации наблюдается многократное увеличение количества ТМК и уровня экспрессии активационных маркеров тромбоцитов и моноцитов ex vivo. Используемая панель моноклональных антител и примененные стратегии гейтирования обеспечивают оценку относительного и абсолютного количества ТМК и их фенотипических характеристик как в общей популяции (CD45⁺CD14⁺) моноцитов, так и в субпопуляциях «классических» (CD14⁺CD16^-), «промежуточных» (CD14⁺CD16⁺) и «неклассических» (CD14^lowCD16⁺) моноцитов. Выработанный подход позволяет оценить вклад отдельных субпопуляций моноцитов в формирование ТМК и степень их участия в физиологических и патофизиологических процессах. В отдельных образцах было выявлено увеличение количества ТМК, сопровождавшееся существенным повышением в них экспрессии активационного маркера тромбоцитов CD62P и снижением экспрессии его моноцитарного лиганда CD162. Данные изменения могут свидетельствовать об изменении активационного статуса комплексообразующих клеток и возможном участии ТМК в патофизиологических механизмах некоторых акушерских осложнений. Иммунофенотипирование ТМК позволяет дополнительно охарактеризовать их провоспалительный, прокоагулянтный и адгезионный потенциал и может быть применено как в фундаментальных исследованиях, так и в целях диагностики. В частности, данный метод может быть использован для определения и характеристики ТМК при акушерских осложнениях, сопровождающихся воспалением и нарушениями гемостаза.

1. Aleva F.E., Temba G., de Mast Q., Simons S.O., de Groot P.G., Heijdra Y.F., van der Ven A. Increased plateletmonocyte interaction in stable COPD in the absence of platelet hyper-reactivity. Respiration, 2018, Vol. 95, no. 1, pp. 35-43.

2. Allen N., Barrett T.J., Guo Y., Nardi M., Ramkhelawon B., Rockman C.B., Hochman J.S., Berger J.S. Circulating monocyte-platelet aggregates are a robust marker of platelet activity in cardiovascular disease. Atherosclerosis, 2019, Vol. 282, pp. 11-18.

3. Dopheide J.F., Rubrech J., Trumpp A., Geissler P., Zeller G.C., Bock K., Dunschede F., Trinh T.T., Dorweiler B., Munzel T., Radsak M.P., Espinola-Klein C. Leukocyte-platelet aggregates-a phenotypic characterization of different stages of peripheral arterial disease. Platelets, 2016, Vol. 27, no. 7, pp. 658-667.

4. Finsterbusch M., Schrottmaier W.C., Kral-Pointner J.B., Salzmann M., Assinger A. Measuring and interpreting platelet-leukocyte aggregates. Platelets, 2018, Vol. 29, no. 7, pp. 677-685.

5. Freedman J.E., Loscalzo J. Platelet-monocyte aggregates: bridging thrombosis and inflammation. Circulation, 2002, Vol. 105, no. 18, pp. 2130-2132.

6. Gerrits A.J., Frelinger A.L. 3rd, Michelson A.D. Whole blood analysis of leukocyte-platelet aggregates. Curr. Protoc. Cytom., 2016, Vol. 78, pp. 6.15.1-6.15.10.

7. Granja T., Schad J., Schussel P., Fischer C., Haberle H., Rosenberger P., Straub A. Using six-colour flow cytometry to analyse the activation and interaction of platelets and leukocytes – a new assay suitable for bench and bedside conditions. Thromb. Res., 2015, Vol. 136, no. 4, pp. 786-796.

8. Harding S.A., Din J.N., Sarma J., Jessop A., Weatherall M., Fox K.A., Newby D.E. Flow cytometric analysis of circulating platelet-monocyte aggregates in whole blood: methodological considerations.Thromb. Haemost., 2007, Vol. 98, no. 2, pp. 451-456.

9. Hermann A., Rauch B.H., Braun M., Schror K., Weber A.A. Platelet CD40 ligand (CD40L)-subcellular localization, regulation of expression, and inhibition by clopidogrel. Platelets, 2001, Vol. 12, no. 2, pp. 74-82.

10. Joseph J.E., Harrison P., Mackie I.J., Isenberg D.A., Machin S.J. Increased circulating platelet-leucocyte complexes and platelet activation in patients with antiphospholipid syndrome, systemic lupus erythematosus and rheumatoid arthritis. Br. J. Haematol., 2001, Vol. 115, no. 2, pp. 451-459.

11. Kullaya V., van der Ven A., Mpagama S., Mmbaga B.T., de Groot P., Kibiki G., de Mast Q. Platelet-monocyte interaction in Mycobacterium tuberculosis infection. Tuberculosis, 2018, Vol. 111, pp. 86-93.

12. Loguinova M., Pinegina N., Kogan V., Vagida M., Arakelyan A., Shpektor A., Margolis L., Vasilieva E. Monocytes of different subsets in complexes with platelets in patients with myocardial infarction. Thromb. Haemost., 2018, Vol. 118, no. 11, pp. 1969-1981.

13. Macey M.G., Bevan S., Alam S., Verghese L., Agrawal S., Beski S., Thuraisingham R., MacCallum P.K. Platelet activation and endogenous thrombin potential in pre-eclampsia. Thromb. Res., 2010, Vol. 125, no. 3, pp. e76-e81.

14. McEver R.P., Selectins: lectins that initiate cell adhesion under flow. Curr. Opin. Cell Biol., 2002, Vol. 14, no. 5, pp. 581-586.

15. Michelson A.D., Barnard M.R., Krueger L.A., Valeri C.R., Furman M.I. Circulating monocyte-platelet aggregates are a more sensitive marker of in vivo platelet activation than platelet surface P-selectin: studies in baboons, human coronary intervention, and human acute myocardial infarction. Circulation, 2001, Vol. 104, no. 13, pp. 1533-1537.

16. Passacquale G., Vamadevan P., Pereira L., Hamid C., Corrigall V., Ferro A. Monocyte-platelet interaction induces a pro-inflammatory phenotype in circulating monocytes. PLoS ONE, 2011, Vol. 6, no. 10, e25595. doi: 10.1371/journal.pone.0025595.

17. Shantsila E., Lip G.Y. The role of monocytes in thrombotic disorders. Insights from tissue factor, monocyteplatelet aggregates and novel mechanisms. Thromb. Haemost., 2009, Vol. 102, no. 5, pp. 916-924.

18. Serebryanaya N.B., Shanin S.N., Fomicheva E.E., Yakutseni P.P. Blood platelets as activators and regulators of inflammatory and immune reactions. Part 2. Thrombocytes as participants of immune reactions. Medical Immunology (Russia), 2019, Vol. 21, no. 1, pp. 9-20. doi: 10.15789/1563-0625-2019-1-9-20.

19. Ziegler-Heitbrock L., Ancuta P., Crowe S., Dalod M., Grau V., Hart D.N., Leenen P.J., Liu Y.J., MacPherson G., Randolph G.J., Scherberich J., Schmitz J., Shortman K., Sozzani S., Strobl H., Zembala M., Austyn J.M., Lutz M.B. Nomenclature of monocytes and dendritic cells in blood. Blood, 2010, Vol. 116, no. 16, pp. e74-e80.