РАЗРАБОТКА ПОРЯДКА АТТЕСТАЦИИ СТАНДАРТНОГО ОБРАЗЦА МЕТИОНИОВОЙ ФОРМЫ ИНТЕРФЕРОНА АЛЬФА-2b ДЛЯ ПОДТВЕРЖДЕНИЯ ПОДЛИННОСТИ МЕТОДОМ ПЕПТИДНОГО КАРТИРОВАНИЯ

Оценка подлинности белков, полученных с помощью технологии рекомбинантной ДНК, является важным этапом подтверждения эффективности и безопасности препаратов, созданных на их основе. Один из основных способов оценки подлинности заключается в сравнении структур молекул испытуемого и стандартного образца с помощью метода пептидного картирования с хроматографическим разделением продуктов ферментолиза. В получении достоверных результатов существенную роль играет выбор стандартного образца сравнения. Для субстанции интерферона альфа-2b, содержащей N-концевой метионин, использование образца Interferon CRS (Chemical Reference Substances), рекомендованного Европейским управлением по качеству лекарственных средств, не корректно, поскольку данная субстанция является безметиониновой.

В данной работе представлены результаты разработки порядка аттестации отраслевого стандартного образца (ОСО) метиониновой формы интерферона альфа-2b. Область применения данного ОСО – подтверждение подлинности метиониновой формы субстанции интерферона альфа-2b методом пептидного картирования с обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографией.

На начальном этапе аттестации, в связи с изменением области применения субстанции-кандидата ОСО, была изменена форма ее выпуска и проведена оценка качества по всем показателям, предусмотренным спецификацией производителя. Далее в условиях воспроизводимости по валидированной методике ВЭЖХ (с предварительным трипсинолизом белка) было получено 30 пептидных карт кандидата в ОСО.

Было показано, что условия гидролиза, а именно выбор трипсина, существенно влияют на профиль пептидной карты. Таким образом, в описании условий применения ОСО должно быль приведено указание на конкретного производителя и номер по каталогу данного реагента.

На основании анализа пептидных карт и результатов масс-спектрометрии высокого разрешения было приведено обоснование выбора 8-ми реперных пиков (пиков сравнения). В качестве основного пика с установленным абсолютным временем удерживания был выбран пик с максимально стабильным выходом и интенсивностью. В качестве обязательных для оценки пиков с относительными временами удерживания были выбраны 2 пика: пик, содержащий N-концевой метионин, и пик наибольшей молекулярной массы с установленной аминокислотной последовательностью, составляющей около 11% покрытия молекулы интерферона.

Установлены аттестованные характеристики ОСО в виде диапазонов абсолютного (для 1-го реперного пика) и относительных (для остальных реперных пиков) времен удерживания.

Возможность использования разработанного ОСО для оценки подлинности метиониновых интерферонов альфа-2b была подтверждена методом пептидного картирования в сравнении со стандартом CRS: изученные пики совпали, за исключением пика, соответствующего пептиду, содержащему N-концевой метионин, выявленный в результате масс-спектрометрии высокого разрешения. 

1. Бондарев В.П., Борисевич И.В., Волкова Р.А., Фадейкина О.В. Проблемы аттестации отраслевых стандартных образцов для контроля качества иммунобиологических лекарственных препаратов // Ведомости научного центра экспертизы средств медицинского применения, 2013. Т. 2. С. 28-32. [Bondarev V.P., Borisevich I.V.,Volkova R.A., Fadeykina O.V. The problems of certification of industry standard samples for quality control of immunobiological medicinal products. Vedomosti nauchnogo tsentra ekspertizy sredstv meditsinskogo primeneniya = Bulletin of the Scientific Center for Expertise of Medical Applications, 2013, Vol. 2, pp. 28-32. (In Russ.)]

2. ГОСТ Р ИСО 5725-1-2002 [GOST R ISO 5725-1-2002].

3. Ершов Ф.И., Киселев О.И. Интерфероны и их индукторы (от молекул до лекарств). М.: ГЭОТАРМедиа, 2005. 356 c. [Ershov F.I., Kiselev O.I. Interferons and their inducers (from molecules to drugs)]. Moscow: GEOTAR-Media, 2005. 356 p.

4. Климов В.И., Саканян Е.И., Волкова Р.А., Фадейкина О.В., Мовсесянц А.А., Лебединская Е.В., Шестакова А.П. Анализ потребностей в стандартных образцах, предназначенных для оценки качества биологических лекарственных средств // Биопрепараты. Профилактика, диагностика, лечение, 2017. Т. 17, № 2. С. 87-92. [Klimov V.I., Sakanyan E.I.,Volkova R.A., Fadeykina O.B., Movsesyants A.A., Lebedinskaya E.V., Shestakova A.P. Analysis of requirements for standard samples intended to assess the quality of biological medicinal products. Biopreparaty. Profilaktika, diagnostika, lechenie = Biopreparations. Prevention, Diagnosis, Treatment, 2017, Vol. 17, no. 2, pp. 87-92. (In Russ.)]

5. Соловьев В.Д., Бектемиров Т.А. Интерфероны в теории и практике медицины. М.: Медицина, 1981. 400 c. [Soloviev V.D., Bektemirov T.A. Interferons in theory and practice of medicine]. Moscow: Medicine, 1981. 400 p.

6. Устинникова О.Б., Рунова О.Б., Голощапова Е.О., Корсун Л.В. Теоретическое обоснование выбора субстанции интерферона альфа-2b для аттестации в качестве стандартного образца для оценки подлинности методом пептидного картирования // Биопрепараты. Профилактика, диагностика, лечение, 2016. Т. 16, № 3. С. 161-165. [Ustinnikova O.B., Runova O.B., Goloshchapova E.O., Korsun L.V. The theoretical substantiation of the choice of interferon alfa-2b substance for certification as a standard for authenticating peptide mapping. Biopreparaty. Profilaktika, diagnostika, lechenie = Biopreparations. Prevention, Diagnosis, Treatment, 2016, Vol. 16, no. 3, pp. 161-165. (In Russ.)]

7. Фармакопейная статья предприятия PN 003726/01-180515 [Pharmacopoeia article of the company PN 003726/01-180515].

8. Ben-Bassat A. Amino-terminal processing of proteins. Nature, 1987, pp. 315-326.

9. Dianzani F. Biological basis for the clinical use of interferon. Gut, 1993, Vol. 34, p. 76.

10. European Pharmacopoeia 9.0, 07/2015:1110 “Interferon alfa-2 concentrated solution”.

11. European Pharmacopoeia 9.0, 01/2010:20255 “Peptide mapping”.

12. Kamionka М. Engineering of therapeutic proteins production in Escherichia coli. Current Pharmaceutical Biotechnology, 2011, Vol. 12, pp. 268-274.