ОПРЕДЕЛЕНИЕ УРОВНЯ ЭКСПРЕССИИ мРНК СПЛАЙСИРОВАННЫХ ВАРИАНТОВ DR3 В КРОВИ ПРИ ИНФЕКЦИОННОМ МОНОНУКЛЕОЗЕ

«Рецептор смерти» DR3 играет важную роль в инициации апоптоза, пролиферации или воспаления. Показано участие данного рецептора в различных заболеваниях, в том числе инфекционной природы. В результате альтернативного сплайсинга образуется множество вариантов мРНК DR3, кодирующих мембранные и растворимые формы рецептора с различными функциями. Особенности экспрессии, а также вклад отдельных вариантов DR3 в иммунопатогенез инфекционного мононуклеоза (ИМ) практически не изучены.

Целью настоящей работы явилась разработка, валидация и апробация способов оценки уровня экспрессии и встречаемости сплайсированных вариантов мРНК DR3 в крови с помощью ОТ-ПЦР в реальном времени (ОТ-ПЦР-РВ) и ОТ-ПЦР при ИМ.

Разработанный вариант ОТ-ПЦР-РВ позволил специфично и чувствительно (лимит полуколичественной детекции = 34-35 циклов) определять относительное количество мРНК пула форм DR3, мембранных вариантов DR3 (LARD1a + LARD8), а также долю мРНК мембранных и растворимых форм рецептора у здоровых волонтеров и пациентов с острым инфекционным мононуклеозом (ОИМ). Показана низкая экспрессия в крови мРНК двух альтернативных мембранных вариантов DR3 – LARD1b и DR3beta, что позволяет отнести данные варианты к минорным формам. Обнаружено снижение относительного уровня экспрессии мРНК пула форм DR3 у пациентов с ОИМ по сравнению с условно здоровыми волонтерами на фоне отсутствия различий в экспрессии мРНК мембранных вариантов рецептора.

Для определения качественного вклада в экспрессию мембранных вариантов каждой из форм LARD1a и LARD8 был разработан двухраундовый «гнездовой» вариант ОТ-ПЦР. Показано, что в большинстве образцов здоровых волонтеров и пациентов с ОИМ в экспрессию мРНК мембранных вариантов DR3 вносят свой вклад как основная мембранная LARD1a, так и альтернативная LARD8 формы рецептора.

Разработанные способы оценки уровня экспрессии и встречаемости мРНК DR3 позволяют комплексно охарактеризовать изменения в экспрессии и функционировании данного рецептора, вызванные ИМ. В рамках развития данной работы требуется дальнейшая апробация методики на выборках большего объема.

1. Уткин О.В., Новиков В.В. Рецепторы смерти в модуляции апоптоза // Успехи современной биологии, 2012. Т. 132, №4. С. 381-390. [Utkin O.V., Novikov V.V. Death receptors in modulation of apoptosis. Uspekhi sovremennoy biologii = Biology Bulletin Reviews, 2012, Vol. 132, no. 4, pp. 381-390. (In Russ.)]

2. Уткин О.В., Старикова, В.Д., Новиков В.В. Встречаемость сплайсированных вариантов матричной РНК DR3/LARD при герпесвирусной инфекции // Вопросы вирусологии, 2014. Т. 59, № 6. С. 36-38. [Utkin O.V., Starikova V.D., Novikov V.V. Frequency of occurrence spliced variants of messenger RNA DR3/LARD at herpesviral infection. Voprosy virusologii = Problems of Virology, 2014, Vol. 59, no. 6, pp. 36-38. (In Russ.)]

3. Bamias G., Mishina M., Nyce M. Ross W.G., Kollias G., Rivera-Nieves J., Pizarro T.T., Cominelli F. Role of TL1A and its receptor DR3 in two models of chronic murine ileitis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2006, Vol. 103, no. 22, pp. 8441-8446.

4. Borysenko C.W., A-Palacios V.N.G., Griswold R.D. Li Y., Iyer A.K., Yaroslavskiy B.B., Sharrow A.C., Blair H.C. Death Receptor-3 Mediates Apoptosis in Human Osteoblasts Under Narrowly Regulated Conditions. J. Cell. Physiol., 2006, Vol. 209, no. 3, pp. 1021-1028.

5. Buchan S.L., Taraban V.Y., Slebioda T.J., James S., Cunningham A.F, Al-Shamkhani A. Death receptor 3 is essential for generating optimal protective CD4+ T-cell immunity against Salmonella. Eur. J. Immunol., 2012, Vol. 42, no. 3, pp. 580-588.

6. Chomczynski P., Sacchi N. The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenolchloroform extraction: twenty-something years on. Nat. Protoc., 2006, Vol. 1, no. 2, pp. 581-585.

7. Meylan F., Richard A.C., Siegel R.M. TL1A and DR3, a TNF family ligand-receptor pair that promotes lymphocyte costimulation, mucosal hyperplasia, and autoimmune inflammation. Immunol Rev., 2011, Vol. 244, no. 1, pp. 188-196.

8. Pappu B.P., Borodovsky A., Zheng T.S., Yang X.,Wu P., Dong X., Weng S., Browning B., Scott M.L., Ma L., Su L., Tian Q., Schneider P., Flavell R.A., Dong C., Burkly L.C. TL1A–DR3 interaction regulates Th17 cell function and Th17-mediated autoimmune disease. J. Exp. Med., 2008, Vol. 205, no. 5, pp. 1049-1062.

9. Porquet N., Poirier A., Houle F., Pin A-L.,Gout S.,Tremblay P-L., Paquet E.R., Klinck R., Auger F.A., Huot J. Survival advantages conferred to colon cancer cells by E-selectin-induced activation of the PI3K-NFκB survival axis downstream of Death receptor-3. BMC Cancer., 2011, Vol. 11, p. 285.

10. Qin T. Upregulation of DR3 expression in CD4+ T cells promotes secretion of IL-17 in experimental autoimmune uveitis. Mol. Vis., 2011, Vol. 17, pp. 3486-3493.

11. Screaton G.R., Xu X.N., Olsen A.L. Cowper A.E, Tan R., McMichael A.J. et al. LARD: A new lymphoidspecific death domain containing receptor regulated by alternative pre-mRNA splicing. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, Vol. 94, no. 9, pp. 4615-4619.

12. Sessler T., Healy S., Samali A., Szegezdi E. Structural determinants of DISC function: new insights into death receptor-mediated apoptosis signalling. Pharmacol. Ther., 2013, Vol. 140, pp. 186-199.

13. Stamova B.S., Apperson M., Walker W.L., Tian Y., Xu H., Adamczy P., Zhan X., Liu D.Z., Ander B.P., Liao I.H., Gregg J.P., Turner R.J., Jickling G., Lit L., Sharp F.R. Identification and validation of suitable endogenous reference genes for gene expression studies in human peripheral blood. BMC Medical Genomics., 2009, Vol. 2, p. 49.

14. Twohig J.P., Marsden M., Cuff S.M., Ferdinand J.R., Gallimore A.M., Perks W.V., Al-Shamkhani A., Humphreys I.R., Wang E.C. The death receptor 3/TL1A pathway is essential for efficient development of antiviral CD4+ and CD8+ T-cell immunity. FASEB J., 2012, Vol. 26, no. 8, pp. 3575-3586.

15. Van de Berg P.J., Yong S.L., Remmerswaal E.B., van Lier R.A., ten Berge I.J. Cytomegalovirus-induced effector T cells cause endothelial cell damage. Clin. Vaccine Immunol., 2012, Vol. 19, no. 5, pp. 772-779.

16. Wang J.J., Li Y.F., Jin Y.Y. Wang X., Chen T.X. Effects of Epstein–Barr virus on the development of dendritic cells derived from cord blood monocytes: an essential role for apoptosis. Braz. J. Infect. Dis., 2012, Vol. 16, no. 1, pp. 19-26.