РАЗРАБОТКА И ВАЛИДАЦИЯ МЕТОДИКИ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НЕЙТРАЛИЗУЮЩИХ АНТИТЕЛ К ПЕМБРОЛИЗУМАБУ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА НА ОСНОВЕ ИНГИБИРОВАНИЯ СВЯЗЫВАНИЯ ПЕМБРОЛИЗУМАБА С ЕГО МИШЕНЬЮ PD-1 МЕТОДОМ ИФА

Резюме

Гуманизированные моноклональные антитела могут вызывать нежелательный гуморальный иммунный ответ у пациентов -  образование антител к терапевтическому белковому препарату. Нейтрализующие антилекарственные антитела являются одним из основных факторов, влияющих на безопасность и эффективность проводимой терапии. При невозможности использовать тесты для определения нейтрализующих антител на основе клеточных культур альтернативой могут служить методы конкурентного связывания лекарственного средства и его лиганда. Пембролизумаб относится к противоопухолевым препаратам широкого спектраи представляет собой гуманизированное IgG4 каппа антитело к рецептору запрограммированной клеточной смерти-1 (PD-1) которое блокирует взаимодействие рецептора с его лигандами PD-L1 и PD-L2. В связи со сложностью проведения анализа применение культурального клеточного теста для пембролизумаба невозможно, так как высок риск получения недостоверных результатов.

Цель. Разработка и валидация методики определения нейтрализующих антител к пембролизумабу в сыворотке крови человека на основе ингибирования связывания пембролизумаба с его мишенью PD-1.

Материал и методы. В исследование был использован экспериментальный препарат пембролизумаб RPH-075 (Р-Фарм). В качестве положительного контрольного образца на нейтрализующие антитела использовали Anti-Pembrolizumab антитела KRIBIOLISATM Anti-Pembrolizumab (KEYTRUDA®) ELISA, Индия)). Определение антител проводили методом ИФА с применением кислотной диссоциации иммунного комплекса и с использованием техники ACE (Affinity capture elution).

Результаты. Была разработана и валидирована методика выявления нейтрализующих антител к пембролизумабу, основанная на ингибировании пембролизумаба с его мишенью PD-1 в сочетании с техникой ACE. Разработанная методика была валидирована по показателям: селективность, чувствительность, специфичность, «хук»-эффект, толерантность к присутствию лекарственного препарата, прецизионность. Благодаря применению подходов предварительной обработки образцов (кислотная диссоциация, техника ACE) для анализа нейтрализующих антител, была достигнута чувствительность 100 нг/мл в присутствии циркулирующего пембролизумаба 40 мкг/мл. Так же в данной работе был обоснован метод расчета предела исключения, чувствительности и селективности на основании ROC-анализа и плавающего предела исключения (PSCP) через средние арифметические значения ОП NC и LPC в каждом индивидуальном аналитическом планшете.

Заключение. Разработанная методика определения нейтрализующих антител к пембролизумабу может быть использована для оценки нежелательной иммуногенности препарата пембролизумаба на стадии клинических испытаний.

1. Решение Совета ЕЭК от 03.11.2016 № 89 «Об утверждении Правил проведения исследований биологических лекарственных средств Евразийского экономического союза».

2. Decision of the EEC Council dated 03.11.2016 No. 89 "On approval of the Rules for Conducting Research on Biological Medicinal Products of the Eurasian Economic Union". ----------

3. Butterfield A. M., Chain J. S., Ackermann B. L., & Konrad, R. J. Comparison of assay formats for drug-tolerant immunogenicity testing. Bioanalysis, 2010, 2 no. 12, pp. 1961–1969. DOI: 10.4155/bio.10.136.

4. Chen Y. Q., Thomas G Pottanat T.G., Carter Q.L., Troutt J.S., Konrad R.J., Sloan J.H. Affinity capture elution bridging assay: a novel immunoassay format for detection of anti-therapeutic protein antibodies .Journal of Immunological Methods, 2016, vol. 431, pp. 45-51.

5. DOI: 10.1016/j.jim.2016.02.008

6. Baxi S., Yang A., Gennarelli R.L., Khan N., Wang Z., Boyce L., Deborah K. Immune-related adverse events for anti-PD-1 and anti-PD-L1 drugs: systematic review and meta-analysis. BMJ, 2018, vol.17:360:k793.

7. DOI: 10.1136/bmj.k793.

8. Bourdage J.S., Cook C.A., Farrington D.L., Chain J.S., Konrad R.J. An Affinity Capture Elution (ACE) assay for detection of anti-drug antibody to monoclonal antibody therapeutics in the presence of high levels of drug. Journal of immunological methods, 2007, vol. 327, no.1-2, pp. 10-7.

9. DOI: 10.1016/j.jim.2007.07.004.

10. FDA: Guidance for Industry: Immunogenicity Testing of Therapeutic Protein Products – Developing and Validating Assays for Anti-Drug Antibody Detection. U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration Center for Drug Evaluation and Research (CDER). Center for Biologics Evaluation and Research (CBER) January. 2019.

11. ----------

12. Gupta S., Indelicato S.R., Jethwa V., Kawabata T., Kelley M., Mire-Sluis A.R., Richards S. M., Rup B., Shores E., Swanson S.J., Wakshull E. Recommendations for the design, optimization, and qualification of cell-based assays used for the detection of neutralizing antibody responses elicited to biological therapeutics. Journal of immunological methods. 2007, vol. 321, no.1-2, pp. 10-18.

13. DOI: 10.1016/j.jim.2006.12.004.

14. Gunn 3rd. G. R., Sealey D. C. F., Jamali F., Meibohm B., Ghosh S., Shankar G. From the bench to clinical practice: understanding the challenges and uncertainties in immunogenicity testing for biopharmaceuticals. Clin Exp Immunol, 2016, vol. 184, no. 2, pp. 137-146.

15. DOI: 10.1111/cei.12742.

16. Hu J, Wala I, Han H, Nagatani J, Barger T, Civoli F., Kaliyaperumal A., Zhuang Y., Shalini Gupta S. Comparison of cell-based and non-cell based assay platforms for the detection of clinically relevant anti-drug neutralizing antibodies for immunogenicity assessment of therapeutic proteins. Journal of Immunological Methods, 2015, vol. 321, no. 1-2, pp. 1–18.

17. DOI: 10.1016/j.jim.2006.12.004.

18. Khoja L., Day D., Wei-Wu Chen T., Siu L.L., Hansen AR. Tumour- and class-specific patterns of immune-related adverse events of immune checkpoint inhibitors: a systematic review. Ann Oncol, 2017, vol. 28, no. 10, pp. 2377–85.

19. DOI: 10.1093/annonc/mdx286.

20. Knezevic I., Kang H.N., Thorpe R. Immunogenicity assessment of monoclonal antibody products: a simulated case study correlating antibody induction with clinical outcomes. Biologicals, 2015, vol. 43, no. 5, pp. 5307–17.

21. DOI: 10.1016/j.biologicals.2015.06.009.

22. Krishna M., Nadler S. G. Immunogenicity to biotherapeutics–the role of anti-drug immune complexes. Frontiers in immunology, 2016, vol., pp.721.

23. DOI: 10.3389/fimmu.2016.00021.

24. Mora J., Palmer R., Wagner L., Wu B., Partridge M. 2023 White Paper on Recent Issues in Bioanalysis: ISR for ADA Assays, the Rise of dPCR vs qPCR, International Reference Standards for Vaccine Assays, Anti-AAV TAb Post-Dose Assessment, NanoString Validation, ELISpot as Gold Standard (Part 3 - Recommendations on Gene Therapy, Cell Therapy, Vaccines Immunogenicity & Technologies; Biotherapeutics Immunogenicity & Risk Assessment; ADA/NAb Assay/Reporting Harmonization). Bioanalysis, 2024, vol. 16, no. 7, pp.77–119. DOI:119.10.4155/bio-2024-0024.

25. Niu H., Klem T., Yang J., Qiu Y., Pan L. A biotin-drug extraction and acid dissociation (BEAD) procedure to eliminate matrix and drug interference in a protein complex anti-drug antibody (ADA) isotype specific assay. J Immunol Methods, 2017, no. 446, pp. 30-36.

26. DOI:10.1016/j.jim.2017.04.002.

27. Nakane P.K., Kawaoi A. J. Peroxidase-labeled antibody. A new method of conjugation. Histochem. Cytochem, 1974, vol. 22, no. 2, pp.1084-1091.

28. DOI: 10.1177/22.12.1084.

29. Nath N., Flemming R., Godat B., Urh M. Development of NanoLuc bridging immunoassay for detection of anti-drug antibodies. J Immunol Methods, 2017, no. 450, pp. 17-26.

30. DOI:10.1016/j.jim.2017.07.006.

31. Sasson S. C., Wilkins L. E., Watson R. A., Jolly C., Brain O., Klenerman P., Olsson-Brown A., Fairfax B. Identification of neutralising pembrolizumab anti-drug antibodies in patients with melanoma. Sci Rep, 2021, vol. 11, no. 1, pp. 19253.

32. DOI:10.1038/s41598-021-98700-7.

33. Shankar G., Arkin S., Cocea L., Devanarayan V., Kirshner S., Kromminga A., Quarmby V., Richards S., Schneider C. K., Subramanyam M., Swanson S., Verthelyi D., Yim S. American Association of Pharmaceutical Scientists Assessment and reporting of the clinical immunogenicity of therapeutic proteins and peptides-harmonized terminology and tactical recommendations. AAPS J., 2014, no. 16, pp. 658–73.

34. DOI: 10.1208/s12248-014-9599-2.

35. Richards S. Amaravadi L., Pillutla R., Birnboeck H., Torri A., Kyra J Cowan K.J., Papadimitriou A., Garofolo F., Satterwhite C., Piccoli S., Wu B., Krinos-Fiorotti C., Allinson J., Berisha F., Cocea L., Croft S., Fraser S., Galliccia F., Gorovits B., Gupta S., Gupta V., Haidar S., Hottenstein C., Ishii-Watabe A., Jani D., Kadavil J., Kamerud J., Kramer D., Litwin V., Santos G.M.L., Nelson R., Ni Y., Pedras-Vasconcelos J., Qiu Y., Paul Rhyne P., Safavi A., Saito Y., Savoie N., Kara Scheibner K., Schick E., Siguenza P. Y., Smeraglia J., Staack R.F., Subramanyam M., Sumner G., Thway T., Uhlinger D., Ullmann M., Vitaliti M., Welink J., Whiting C.C., Xue L., Zeng R. White Paper on recent issues in bioanalysis: focus on biomarker assay validation (BAV):(Part 3–LBA, biomarkers and immunogenicity). Bioanalysis, 2016, vol. 8, no. 23, pp. 2475-2496.

36. DOI: 10.4155/bio-2016-4989.

37. Wadhwa M., Knezevic I., Kang H.N., Thorpe R. Immunogenicity assessment of biotherapeutic products: an overview of assays and their utility. Biologicals, 2015, no. 43, pp. 298–306.

38. DOI:0.1016/j.biologicals.2015.06.004.

39. Weiner J. A. , Natarajan H., Calum J., McIntosh C., Yang E. S., Choe M., Papia C. L., Axelrod K. S., Gabriela Kovacikova G., Pegu A., Ackerman M.E. Selection of positive controls and their impact on anti-drug antibody assay performance. J Immunol Methods, 2024, no. 528, pp. 113657.

40. DOI:10.1016/j.jim.2024.113657.

41. Wu B, Chung S, Jiang X-R., McNally J., Pedras-Vasconcelos J., Pillutla R, White J. T., Xu Y., Gupta S. Strategies to determine assay. format for the assessment of neutralizing antibody responses to biotherapeutics. The AAPS journal, 2016, vol. 18, no. 6, pp. 1335-50.

42. DOI:10.1208/s12248-016-9954-6.

43. Wu B.W., Gunn III G.R. Shankar G. Competitive Ligand-Binding Assays for the Detection of Neutralizing Antibodies. Detection and quantification of antibodies to biopharmaceuticals: practical and applied considerations. Detection and Quantification of Antibodies to Biopharmaceuticals, 2011, pp. 175-192.

44. DOI:10.1002/9781118075685.ch10.

45. Wu B., Schnarr M., Devlin J. L., Brown S., Yang T-Y. Approaches to improve drug tolerance and target tolerance in the assessment of neutralizing anti-drug antibodies. Bioanalysis, 2019, vol. 11, no. 22, pp. 2061-2074.

46. DOI:10.4155/bio-2019-0184.

47. Xiang Y., Parng C., Olson K., Seletskaia E., Gorovits B., Jani D., Caiazzo T. , Joyce A. , Donley J. Neutralizing antibody assaydevelopment with high drug and target tolerance to support clinical development of an anti-TFPI therapeutic monoclonal antibody. The AAPS Journal, 2019, vol. 21 no. 3, pp. 1-10.

48. DOI: 10.1208/s12248-019-0320-3.

49. Zoghbi J., Xu Y., Grabert R., Theobald V., Richards S. A breakthrough novel method to resolve the drug and target interference problem in immunogenicity assays. J Immunol Methods, 2015, no.426, pp. 62-69.

50. DOI: 10.1016/j.jim.2015.08.002.