Иммунный ответ, формируемый введением трансгенным мышам ДНК-вектора, содержащего фрагмент кДНК гена рецептора тиреотропного гормона человека

Во всем мире растет число больных аутоиммунными заболеваниями щитовидной железы (диффузный токсический зоб, аутоиммунный тиреоидит). Важнейшим моментом в диагностике диффузного токсического зоба является выявление аутоантител к рецептору тиреотропного гормона (рТТГ) в сыворотке крови больных. Для дифференциальной диагностики антител к антигенам щитовидной железы перспективно тестирование на основе моноклональных антител к рецептору тиреотропного гормона человека, которые можно получить не только в результате иммунизации животных нативным или рекомбинантным белком рецептора тиреотропного гормона, но и при ДНК-иммунизации генно-инженерными конструкциями, содержащими фрагменты гена рТТГ. На базе мРНК, выделенной нами из ткани щитовидной железы пациентов с диффузным токсическим зобом, клонирован ряд фрагментов гена рецептора тиреотропина, которые могли бы быть пригодны для ДНК-иммунизации животных; оценить один из сконструированных векторов – pVAX1рТТГ (1160) в качестве иммуногена на мышиной модели стало целью настоящей работы. Наличие фрагмента гена рецептора тиреотропного гормона, размером 1160 п.н., который был трансфецирован в составе вектора pVAX1 в клеточную линию СНО, было установлено методами иммуноблоттинга и ИФА. Иммунный ответ, формирующийся на введение мышам линии BALB/с вектора pVAX1, содержащего фрагмент кДНК гена рецептора тиреотропного гормона человека, был выявлен в разных вариантах ИФА. Иммунизация животных ДНК-вектором pVAX1-рTТГ по экспериментально подобранной схеме оказалась эффективной для формирования у опытных животных спленоцитов, секретирующих антитела к рецептору тиреотропного гормона человека, которые были использованы для успешной гибридизации. Это подтверждалось результатами определения антитело – продукции к рецептору тиреотропного гормона человека в сыворотках крови мышей: уровень продукции антител оставался высоким (титр более 1:10 000) на 8-й неделе эксперимента. В результате селекции индивидуальных клонов по критериям пролиферативной активности и стабильности продукции антител были отобраны наиболее стабильные культуры гибридом, секретирующие МкАт против рецептора тиреотропного гормона человека.

1. Зубков А.В., Андреева М.А., Сидоров А.В., Милованова А.В., Бутова Л.Г. Клонирование гена рецептора тиреотропного гормона человека // Российский иммунологический журнал, 2019. Т. 13 (22), № 2. С. 278-280. doi: 10.31857/S102872210006600-5.

2. Руководство по лабораторным животным и альтернативным моделям в биомедицинских технологиях. Под ред. Н.Н. Каркищенко и С.В.Грачева. М.: ПРОФИЛЬ-2С, 2010. 358 с.

3. Chen C.R., Pichurin P., Nagayama J. The thyrotropin receptor autoantigen in Graves’ disease is the culprit as well as the victim J. Clin. Invest., 2003, Vol. 111, no. 12, pp. 1897-1904.

4. Feng K., Zheng X., Wang R. Long-Term Protection Elicited by a DNA Vaccine Candidate Expressing the prM-E Antigen of Dengue Virus Serotype 3 in Mice. Front. Microbiol., 2020, Vol. 10, 87. doi: 10.3389/fcimb.2020.00087.

5. Gilbert J.A., Kalled S.L., Moorhead J. Treatment of autoimmune hyperthyroidism in murine model Graves’ disease with tumor necrosis factor family ligand ingibitor suggest a key role for B cell activating factor in disease pathohology. Endocrinology, 2006, Vol. 147, no. 10, pp. 4561-4568.

6. Jansson L., Vrolix K., Jahraus A. Immunotherapy with apitopes blocks the immune response to TSH receptor in HLA-DR transgenic mice. Endocrinology, 2018, Vol. 159, no. 9, pp. 3446-3457.

7. Lerner A., Jeremias P., Matthias T. The world incidence and prevalence of autoimmune diseases is increasing. Int. J. Celiac Dis., 2015, Vol. 3, no. 4, pp. 151-155.

8. Moshkelgosha S., So P.W., Deasy N. Cutting edge: Retrobulbar inflammation, adipogenesis, and acute orbital congestion in a preclinical female mouse model of graves’ orbitopathy induced by thyrotropin receptorplasmid-in vivo electroporation. Endocrinology, 2013, Vol. 154, pp. 3008-3015.

9. Rapoport B., McLachlan S.M. TSH receptor cleavage into subunits and shedding of the A-subunit; a molecular and clinical perspective. Endocr. Rev., 2016, Vol. 37, no. 2, pp. 114-134.

10. Peng J., Xiao Y., Wan X. Enhancement of Immune response and anti-infection of mice by porcine antimicrobial peptides and interleukin-4/6 fusion gene encapsulated in chitosan nanoparticles. Vaccine, 2020, Vol. 8, 552. doi: 10.3390/vaccines8030552.

11. Schluter A., Horstmann M., Diaz-Cano S. Genetic immunization with mouse thyrotropin hormonereceptor plasmid breaks self tolerance for a murine model of autoimmune thyroid disease and Graves’ orbitopathy. Clin. Exp. Immunol., 2017, Vol. 191, pp. 255-267.

12. Sonaimuthu P., Ching X.T., Fong M.Y. Induction of protective immunity against toxoplasmosis in BALB/c mice vaccinated with toxoplasma gondii rhoptry. Front. Microbiol. 2016, Vol. 7, 808. doi: 10.3389/fmicb.2016.00808.

13. Towbin H., Stachelin T., Gardon J. Electrophoretic transfer of protein from polyacrylamide gel stonitrocellulose sheets. Procedures and some applications. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 1979, Vol. 76, pp. 4350-4354.

14. Weetman A.P, Jateman M.E, Ealey P.A. Thyroid stimulating antibody activity between different immunoglobulin G subclasses. J. Clin. Invest., 1990, Vol. 86, no. 3, pp. 723-727.

15. Zheng B., Ding J., Chen X. Immuno efficacy of a t. Gondii secreted protein with an altered thrombospondin repeat (TgSPATR) as a novel DNA vaccine candidate against acute toxoplasmosis in BALB/c mice. Front. Microbiol., 2017, Vol. 8, 216. doi: 10.3389/fmicb.2017.00216.

16. Zheng X., Chen H., Wang R. Effective Protection induced by a monovalent DNA vaccine against Dengue Virus (DV) serotype 1 and a bivalent DNA vaccine against DV1 and DV2 in Mice. Front. Cell. Infect. Microbiol., 2017, Vol. 7, 175. doi: 10.3389/fcimb.2017.00175.

17. Zheng X., Yu X., Wang Y. Complete protection for mice conferred by a DNA vaccine based on the Japanese encephalitis virus P3 strain used to prepare the inactivated vaccine in China. Virol. J., 2020, Vol. 17, 126. doi.org/10.1186/s12985-020-01400-3.