Фенотипические характеристики натуральных киллеров после генерации и активации in vitro
https://doi.org/10.15789/1563-0625-PCO-3068
Аннотация
За счет разработки эффективных методов активации и генерации натуральных киллеров in vitro современныe способы адоптивной иммунотерапии онкологических больных получили новое развитие. Целью данного исследования явилось изучение экспрессии маркеров активации на натуральных киллерах после генерации и активации in vitro с помощью проточной цитометрии. Мононуклеарные клетки выделяли из периферической крови 10 доноров на градиенте плотности и культивировали в среде RPMI-1640 (Sigma-Aldrich, Германия) с добавлением IL-2 и клеток TMDК562-15 в течение 14 дней. Цитофлуориметрический анализ проводили на 0-й, 7-й и 14-й дни культивирования на цитометре Image Stream MkII (Luminex, США). Применяли 10-цветную панель моноклональных меченых антител к СD45, СD3, СD56, СD16 и маркерам активации CD38/HLA-DR/CD25 (BD Biosciences, США). Цитотоксическую активность натуральных киллеров, полученных от доноров, оценивали на 14-й день культивирования в отношении опухолевых мишеней AsPC-1, А-549, MDA-MB-231 и PC-3, при соотношении «эффектор:мишень» 5:1 и 10:1 в течение 12 часов. Статистический анализ осуществляли с помощью MS Excel 2016, TIBCO STATISTICA 11. До начала культивирования доля натуральных киллеров в составе мононуклеарных клеток составляла в среднем 12%, из которых CD38/HLA-DR/CD25 экспрессировали 7,6%, 0,7%, 0%. Длительное культивирование мононуклеарных клеток in vitro привело к активации и изменению доли субпопуляций лимфоцитов. Количество натуральных киллеров на 14-й день культивирования увеличилось в 390 раз, и доля натуральных киллеров составила 86,5%. Среди них на 14-й день культивации активационные рецепторы CD38/HLA-DR/CD25 экспрессировали соответственно 34,7%, 36,5%, 5% натуральных киллеров. При изучении цитотоксичности полученных натуральных киллеров по отношению к клеткам различных опухолевых линий через 12 часов после внесения натуральных киллеров наблюдали 100% лизис клеток-мишеней. Жизнеспособность клеток у всех доноров была более 98%, на 7-й день несколько снижалась и в среднем составляла 81%, к окончанию культивирования показатель достигал уровня более 95%. Предложенный способ культивирования мононуклеарных клеток позволяет значительно увеличить пролиферативную активность и экспрессию активационных маркеров натуральных киллеров при сохранении высокой жизнеспособности популяции, полученной в процессе культивирования. Функциональная активность натуральных киллеров подтверждается в цитотоксическом тесте по отношению к клеткам опухолевых линий.
Ключевые слова
Об авторах
Е. В. АбакушинаРоссия
Абакушина Е.В. – д.м.н., руководитель отдела по разработке и исследованиям в области иммунологии, заместитель генерального директора
123298, Москва, ул. 3-я Хорошевская, 16, корп. 2.
Р. В. Журиков
Россия
Журиков Р.В. – научный сотрудник отдела по разработке и исследованиям в области иммунологии
123298, Москва, ул. 3-я Хорошевская, 16, корп. 2.
К. Д. Балышева
Россия
Балышева К.Д. – лаборант-исследователь отдела по разработке и исследованиям в области иммунологии
123298, Москва, ул. 3-я Хорошевская, 16, корп. 2.
М. В. Бекетова
Россия
Бекетова М.В. – лаборант-исследователь отдела по разработке и исследованиям в области иммунологии
123298, Москва, ул. 3-я Хорошевская, 16, корп. 2.
С. А. Румянцев
Россия
Румянцев С.А. – д.м.н., профессор, заведующий отделом молекулярной онкологии и иммунологии
Москва
Список литературы
1. Абакушина Е.В. Рекомбинантная клеточная линия TMDK562-15, проявляющая способность к активации и пролиферации ЕК клеток человека. Патент RU 2803178 C1, 07.09.2023.
2. Абакушина Е.В. Метод проточной цитометрии для оценки NK-клеток и их активности // Клиническая лабораторная диагностика, 2015. Т. 60, № 11. C. 37-44.
3. Абакушина Е.В., Козлов И.Г. Иммунотерапия с использованием естественных киллеров в лечении онкологических заболеваний // Российский иммунологический журнал, 2016. Т. 10, № 2. С. 131-142.
4. Абакушина Е.В., Маризина Ю.В., Каприн А.Д. Морфо-функциональная характеристика лимфоцитов человека после активации in vitro // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2016. Т. 161, № 5. С. 678-683.
5. Bald T., Krummel M.F., Smyth M.J., Barry K.C. The NK cell–cancer cycle: advances and new challenges in NK cell–based immunotherapies. Nat. Immunol., 2020, Vol. 21, no. 8, pp. 835-847.
6. Kiessling, R., Klein E., Wigzell H. “Natural” killer cells in the mouse. I. Cytotoxic cells with specificity for mouse Moloney leukemia cells. Specificity and distribution according to genotype. Eur. J. Immunol., 1975, vol. 5, no. 2, pp. 112-117.
7. Klimpel G.R., Niesel D.W., Klimpel K.D. Natural cytotoxic effector cell activity against Shigella flexneri-infected HeLa cells. J. Immunol., 1986, Vol. 136, no. 3, pp 1081-1086.
8. Lamers-Kok N., Panella D., Georgoudaki A.M., Liu H., Özkazanc D., Kučerová L., Duru A.D., Spanholtz J., Raimo M. Natural killer cells in clinical development as non-engineered, engineered, and combination therapies. J. Hematol. Oncol., 2022, Vol. 15, no. 1, 164. doi: 10.1186/s13045-022-01382-5.
9. Macfarlan R.I., Burns W.H., White D.O. Two cytotoxic cells in peritoneal cavity of virus-infected mice: antibody-dependent macrophages and nonspecific killer cells. J. Immunol., 1977, Vol. 119, no. 5, pp. 1569-1574.
10. Melaiu O., Lucarini V., Cifaldi L., Fruci D. Influence of the Tumor Microenvironment on NK Cell Function in Solid Tumors. Front. Immunol., 2019, Vol. 10, 3038. doi: 10.3389/fimmu.2019.03038.
11. Ortaldo J.R., Oldham R.K., Cannon G.C., Herberman R.B. Specificity of natural cytotoxic reactivity of normal human lymphocytes against a myeloid leukemia cell line. J. Natl Cancer Inst., 1977, Vol. 59, no. 1, pp. 77-82.
12. Shimasaki N., Jain A., Campana D. NK cells for cancer immunotherapy. Nat. Rev. Drug Discov., 2020, Vol. 19, pp. 200-218.
13. Voigt J., Malone D.F.G., Dias J., Leeansyah E., Björkström N.K., Ljunggren H.-G., Gröbe L., Klawonn F., Heyner M., Sandberg J.K. Proteome analysis of human CD56neg NK cells reveals a homogeneous phenotype surprisingly similar to CD56dim NK cells. Eur. J. Immunol., 2018, Vol. 48, pp. 1456-1469.
Дополнительные файлы
Рецензия
Для цитирования:
Абакушина Е.В., Журиков Р.В., Балышева К.Д., Бекетова М.В., Румянцев С.А. Фенотипические характеристики натуральных киллеров после генерации и активации in vitro. Медицинская иммунология. 2025;27(2):297-302. https://doi.org/10.15789/1563-0625-PCO-3068
For citation:
Abakushina E.V., Zhurikov R.V., Balysheva K.D., Beketova M.V., Rumyantsev S.A. Phenotypic characteristics of natural killer cells after their generation and activation in vitro. Medical Immunology (Russia). 2025;27(2):297-302. (In Russ.) https://doi.org/10.15789/1563-0625-PCO-3068