Разработка технологии очистки, биохимическая и иммунологическая характеристика рекомбинантного химерного антигена для оценки Т-клеточного иммунитета против коронавирусной инфекции

Диагностика специфического Т-клеточного иммунитета к антигенным детерминантам SARS-CoV-2 у пациентов представляется все более важной задачей ввиду накопления данных о роли Т-клеточного иммунного ответа в протекании коронавирусной инфекции и клиренсе SARS-CoV-2 в случае вторичной инфекции. Ранее нами был разработан рекомбинантный антиген CorD_PS для оценки Т-клеточного противовирусного иммунитета, содержащий консервативные и иммуногенные последовательности структурных белков коронавируса SARS-CoV-2. Был получен его штаммпродуцент E. coli CorD_PS со стабильной экспрессией рекомбинантного антигена CorD_PS. Целью настоящей работы является разработка лабораторной технологии получения рекомбинантного антигена CorD_PS, проведение контроля качества полученного химерного белка и изучение его иммунологической активности. Отработку условий культивирования клеток E. coli CorD_PS проводили в конических колбах в среде LB-M_Km при 37 °C, затем масштабировали в ферментере объемом 30 л. Экспрессию индуцировали добавлением ИПТГ. Контроль экспрессии осуществляли в лизатах культур в 12% ПААГ в денатурирующих условиях. Полученную биомассу лизировали с помощью ультразвукового дезинтегратора с последующим центрифугированием. Были подобраны составы лизирующего и солюбилизирующего буферов, а также условия рефолдинга рекомбинантного белка. Для очистки растворенного белка использовали последовательно катионобменную (SP-сефароза), гидрофобную (Butyl-сефароза) и эксклюзионную (Sephacryl S-200 HR) хроматографии. Белковые примеси в препарате определяли методами обращенно-фазовой ВЭЖХ и электрофореза в 12% ПААГ, остаточные липополисахариды определяли с помощью гель-тромб варианта ЛАЛ-теста, остаточные белки штамма-продуцента – методом иммуноферментного анализа, остаточную ДНК штамма-продуцента – методом связывания с красителем PicoGreen. Контроль специфичности осуществляли методом непрямого иммуноферментного анализа. Оценку продукции цитокинов CD4⁺Т-лимфоцитами в ответ на их стимуляцию рекомбинантным антигеном ex vivo проводили на проточном цитофлуориметре. Выход биомассы при культивировании E. coli CorD_PS в 30 л ферментере составил до 20 г/л за 4 часа индукции 0,1 мМ ИПТГ. Последовательная отмывка телец включения от бактериальных клеточных компонентов и их последующая солюбилизация в буфере, содержащем 8 М мочевину, позволил получить раствор денатурированного антигена с концентрацией 10 мг/мл. Эффективность рефолдинга разведением составила 75%. После трех этапов хроматографической очистки были получены образцы белка с концентрацией 1,2-1,4 мг/мл, чистотой по ВЭЖХ 98,43%, соответствующие ключевым параметрам качества согласно ОФС.1.7.1.0007.15. Рекомбинантный антиген показал специфическое связывание с образцом Первого международного стандарта ВОЗ и образца СОП № 3 анти-SARS-CoV-2 иммуноглобулинов человека в установленном диапазоне концентраций. CD4⁺Т-лимфоциты эффективно отвечали на обработку рекомбинантным антигеном увеличением продукции IFNγ. Оптимальная концентрация рекомбинантного коронавирусного антигена составила 5 мкг/мл. Разработанный технологический процесс позволяет получать 5-7 грамм антигена коронавирусного рекомбинантного CorD_PS за один цикл культивирования в 30 л ферментационной среды с ключевыми параметрами качества согласно ОФС.1.7.1.0007.15. В результате исследований специфической иммунологической активности рекомбинантного коронавирусного антигена CorD_PS была подтверждена концепция возможности его использования в качестве диагностикума для определения формирования Т-клеточного иммунного ответа.

1. Копать В.В., Рябченкова А.А., Чирак Е.Л., Чирак Е.Р., Саенко А.И., Колмаков Н.Н., Симбирцев А.С., Духовлинов И.В., Тотолян А.А. Разработка структуры и штамма-продуцента E. coli для антигена, содержащего последовательности белков N, S, M, E коронавируса SARS-CоV-2 // Инфекция и иммунитет, 2023. Т. 13, № 4, C. 653-662.

2. ОФС. 1.7.1.0007.15. Лекарственные средства, получаемые методами рекомбинантных ДНК. Государственная фармакопея Российской Федерации. XIII изд. 2016. С. 521-541. [

3. Bertoletti A., le Bert N., Qui M., Tan A.T. SARS-CoV-2-specific T cells in infection and vaccination. Cell. Mol. Immunol., 2021, Vol. 18, no. 10, pp. 2307-2312.

4. Bertoletti A., le Bert N., Tan A.T. SARS-CoV-2-specific T cells in the changing landscape of the COVID-19 pandemic. Immunity, 2022, Vol. 55, no. 10, pp. 1764-1778.

5. Burgess R.R. Refolding solubilized inclusion body proteins. Methods Enzymol., 2009, Vol. 463, pp. 259-282.

6. Clark E.D.B. Protein refolding for industrial processes. Curr. Opin. Biotechnol., 2001, Vol. 12, no. 2, pp. 202-207.

7. Čejka J., Vodrázka Z., Salák J. Carbamylation of globin in electrophoresis and chromatography in the presence of urea. Biochim. Biophys. Acta, 1968, Vol. 154, no. 3, pp. 589-591.

8. Datar R.V., Cartwright T., Rosen C.G. Process economics of animal cell and bacterial fermentations: a case study analysis of tissue plasminogen activator. Biotechnology, 1993, Vol. 11, no. 3, pp. 349-357.

9. Fahnert B., Lilie H., Neubauer P. Inclusion bodies: formation and utilization. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol., 2004, Vol. 89, pp. 93-142.

10. Fallet B., Foglierini M., Porret R., Alcaraz-Serna A., Sauvage C., Jenelten R., Caplanusi T., Gilliet M., Perez L., Fenwick C., Genolet R., Harari A., Bobisse S., Gottardo R., Pantaleo G., Muller Y.D. Intradermal skin test with mRNA vaccines as a surrogate marker of T cell immunity in immunocompromised patients. J. Infect., 2023, Vol. 87, no. 2, pp. 111-119.

11. GeurtsvanKessel C.H., Geers D., Schmitz K.S., Mykytyn A.Z., Lamers M.M., Bogers S., Scherbeijn S., Gommers L., Sablerolles R.S.G., Nieuwkoop N.N., Rijsbergen L.C., van Dijk L.L.A., de Wilde J., Alblas K., Breugem T.I., Rijnders B.J.A., de Jager H., Weiskopf D., van der Kuy P.H.M., Sette A., de Vries R.D. Divergent SARSCoV-2 Omicron-reactive T and B cell responses in COVID-19 vaccine recipients. Sci. Immunol., 2022, Vol. 7, no. 69, eabo2202. doi: 10.1126/sciimmunol.abo2202.

12. Hagel P., Gerding J.J., Fieggen W., Bloemendal H. Cyanate formation in solutions of urea: I. Calculation of cyanate concentrations at different temperature and pH. Biochim. Biophys. Acta, 1971, Vol. 243, no. 3, pp. 366-373.

13. Hartley D.L., Kane J.F. Properties of inclusion bodies from recombinant Escherichia coli. Biochem. Soc. Trans., 1988, Vol.16, no. 2, pp. 101-102.

14. Kalimuddin S., Tham C.Y.L., Qui M., de Alwis R., Sim J.X.Y., Lim J.M.E., Tan H.C., Syenina A., Zhang S.L., le Bert N., Tan A.T., Leong Y.S., Yee J.X., Ong E.Z., Ooi E.E., Bertoletti A., Low J.G. Early T cell and binding antibody responses are associated with COVID-19 RNA vaccine efficacy onset. Med, 2021, Vol. 2, no. 6, pp. 682-688.

15. Laslo A.C., Ganea E., Obinger C. Refolding of hexameric porcine leucine aminopeptidase using a cationic detergent and dextrin-10 as artificial chaperones. J. Biotechnol., 2009, Vol. 140, no. 3-4, pp. 162-168.

16. Lin M.F., Williams C., Murray M.V., Conn G., Ropp P.A. Ion chromatographic quantification of cyanate in urea solutions: estimation of the efficiency of cyanate scavengers for use in recombinant protein manufacturing. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci., 2004, Vol. 803, no. 2, pp. 353-362.

17. Lippincott J., Apostol I. Carbamylation of cysteine: a potential artifact in peptide mapping of hemoglobins in the presence of urea. Analyt. Biochem., 1999, Vol. 267, no. 1, pp. 57-64.

18. Liu L., Wang P., Nair M.S., Yu J., Rapp M., Wang Q., Luo Y., Chan J.F., Sahi V., Figueroa A., Guo X.V., Cerutti G., Bimela J., Gorman J., Zhou T., Chen Z., Yuen K.Y., Kwong P.D., Sodroski J.G., Yin M.T., Ho D.D. Potent neutralizing antibodies against multiple epitopes on SARS-CoV-2 spike. Nature, 2020, Vol. 584, no. 7821, pp. 450-456.

19. Matyushenko V., Isakova-Sivak I., Kudryavtsev I., Goshina A., Chistyakova A., Stepanova E., Prokopenko P., Sychev I., Rudenko L. Detection of IFNγ-secreting CD4+ and CD8+ memory T cells in COVID-19 convalescents after stimulation of peripheral blood mononuclear cells with live SARS-CoV-2. Viruses, 2021, Vol. 13, no. 8, 1490. doi: 10.3390/v13081490.

20. Mitraki A., Fane B., Haase-Pettingell C., Sturtevant J., King J. Global suppression of protein folding defects and inclusion body formation. Science, 1991, Vol. 253, no. 5015, pp. 54-58.

21. Moga E., Lynton-Pons E., Domingo P. The robustness of cellular immunity determines the fate of SARSCoV-2 infection. Front. Immunol., 2022, Vol. 13, 904686. doi: 10.3389/fimmu.2022.904686.

22. Patra A.K., Mukhopadhyay R., Mukhija R., Krishnan A., Garg L.C., Panda A.K. Optimization of inclusion body solubilization and renaturation of recombinant human growth hormone from Escherichia coli. Protein Expr. Purif., 2000, Vol. 18, no. 2, pp. 182-192.

23. Rudolph R., Lilie H. In vitro folding of inclusion body proteins. FASEB J., 1996, Vol. 10, no. 1, pp. 49-56.

24. Sekine T., Perez-Potti A., Rivera-Ballesteros O., Strålin K., Gorin J.B., Olsson A., Llewellyn-Lacey S., Kamal H., Bogdanovic G., Muschiol S., Wullimann D.J., Kammann T., Emgård J., Parrot T., Folkesson E., Karolinska COVID-19 Study Group, Rooyackers O., Eriksson L.I., Henter J.I., Sönnerborg A., Buggert M. Robust T cell immunity in convalescent individuals with asymptomatic or mild COVID-19. Cell, 2020, Vol. 183, no. 1, pp. 158-168.

25. Singh S.M., Panda A.K. Solubilization and refolding of bacterial inclusion body proteins. J. Biosci. Bioeng., 2005, Vol. 99, no. 4, pp. 303-310.

26. Stark G.R. Reactions of cyanate with functional groups of proteins. III. Reactions with amino and carboxyl groups. Biochemistry, 1965, Vol. 4, no. 6, pp. 1030-1036.

27. Sun S., Zhou J.Y., Yang W., Zhang H. Inhibition of protein carbamylation in urea solution using ammoniumcontaining buffers. Analyt. Biochem., 2014, Vol. 446, pp. 76-81.

28. Volkin D.B., Mach H., Middaugh C.R. Degradative covalent reactions important to protein stability. Mol. Biotechnol., 1997, Vol. 8, pp. 105-122.