Особенности преаналитического этапа при количественном определении TREC/KREC в периферической крови

Использование сухих пятен крови (dried blood spots – DBS), полученных из пяток младенцев, имеет много преимуществ по сравнению со сбором образцов цельной крови. Экстрагированная из DBS ДНК может быть использована для выявления генетических заболеваний методом ПЦР, что способствовало развитию популяционного скрининга новорожденных во всем мире. C января 2023 г. в список выявляемых заболеваний входит группа первичных иммунодефицитов (ПИД), связанных с отсутствием или снижением уровней Т- и/или В-лимфоцитов, определяемых в рамках скрининга по уровням молекул TREC и KREC в периферической крови соответственно. Количественный анализ требует особого внимания к биологическому материалу. Цель – оценить влияние преаналитического этапа на количественный анализ уровней TREC/KREC в периферической крови.

Материалом служили 5219 образцов DBS, полученных от младенцев на 3-4-й день жизни, а также DBS, приготовленные из цельной крови 100 условно здоровых лиц в возрасте от 18 до 29 лет. Методом ПЦР-РВ, применяя тест-системы для оценки уровней TREC и KREC в периферической крови, проводили сравнительный анализ количества молекул TREC/KREC в корректно и не корректно взятых DBS от новорожденных и взрослых лиц, а также в зависимости от объема наносимого материала; качество DBS оценивали визуально.

В первые месяцы проекта выявлено значительное количество неправильно взятых образцов – свыше трети всех полученных за каждый соответствующий месяц ДНК-карт. В результате дополнительного обучения медперсонала количество некорректно взятого материала снизилось до уровня, не превышающего 1% от всех ежемесячно собираемых образцов. При использовании ДНК, выделенной из DBS с ошибками нанесения, у большей части образцов (для новорожденных 64%, для взрослых лиц 78%) не удавалось получить результат. В остальных случаях полученные результаты были значительно ниже нормальных уровней содержания TREC/KREC, определяемых в этих же образцах при корректном взятии DBS (во всех случаях p < 0,0001, 95% ДИ). Объем крови, используемый при корректном нанесении на карты Гатри, не влиял на получаемые результаты, уровни TREC и KREC были сопоставимы, при сравнении медиан, рассчитанных для каждой группы образцов, значимых различий не выявлено (p > 0,05).

При количественном анализе уровней TREC/KREC в периферической крови корректно взятый материал имеет принципиальное значение для получения достоверных показателей, в первую очередь для исключения ложноположительных результатов. Чтобы свести к минимуму погрешности преаналитического этапа, для контроля и/или корректировки ошибок, необходимо дополнительное обучение медицинского персонала.

1. Воронин С.В., Куцев С.И. Неонатальный скрининг на наследственные заболевания в России: вчера, сегодня, завтра // Неонатология: Новости. Мнения. Обучение, 2022. Т. 10, № 4. С. 34-39.

2. Григорьев К.И., Харитонова Л.А., Радзинский В.Е., Папышева О.В., Котайш Г.А. Перинатальная медицина и проблемы неонатального скрининга // Медицинская сестра, 2017. № 4. С. 3-9.

3. Сайтгалина М.А., Любимова Н.Е., Останкова Ю.В., Кузнецова Р.Н., Тотолян Арег А. Определение референтных интервалов циркулирующих в крови эксцизионных колец TREC и KREC у лиц старше 18 лет // Медицинская иммунология, 2022. Т. 24, № 6. C. 1227-1236. doi:10.15789/1563-0625-DOR-2587.

4. Сайтгалина М.А., Останкова Ю.В., Любимова Н.Е., Семенов А.В., Кузнецова Р.Н., Тотолян А.А. Модифицированный метод количественного определения уровней TREC и KREC в периферической крови у больных с иммунодефицитными состояниями // Инфекция и иммунитет, 2022. Т. 12, № 5. С. 981-996. doi:10.15789/2220-7619-MMF-2039.

5. Bello S., Ferguson C., Wallis R. Improvements to the newborn bloodspot screening service are required to meet national standards. J. Med. Screen., 2010, Vol. 17, no. 3, pp. 114-120.

6. Edelbroek P.M., van der Heijden J., Stolk L.M. Dried blood spot methods in therapeutic drug monitoring: methods, assays, and pitfalls. Ther. Drug Monit., 2009, Vol. 31, no. 3, pp. 327-336.

7. George R.S., Moat S.J. Effect of dried blood spot quality on newborn screening analyte concentrations and recommendations for minimum acceptance criteria for sample analysis. Clin. Chem., 2016, Vol. 62, no. 3, pp. 466-475.

8. Guthrie R., Susi A.A simple phenylalanine method for detecting phenylketonuria in large populations of newborn infants. Pediatrics, 1963, Vol. 32, pp. 338-343.

9. Lawson A.J., Bernstone L., Hall S.K. Newborn screening blood spot analysis in the UK: influence of spot size, punch location and haematocrit. J. Med. Screen., 2016, Vol. 23, no. 1, pp. 7-16.

10. McCabe E.R., Huang S.Z., Seltzer W.K., Law M.L. DNA microextraction from dried blood spots on filter paper blotters: potential applications to newborn screening. Hum. Genet.,1987, Vol. 75, pp. 213-216.

11. Mei J.V., Alexander J.R., Adam B.W., Hannon W.H. Use of filter paper for the collection and analysis of human whole blood specimens. J. Nutr., 2001, Vol. 131, no. 5, pp. 1631S-1636S.

12. Shepherd A.J., Glenesk A., Niven C.A., Mackenzie J. A Scottish study of heel-prick blood sampling in newborn babies. Midwifery, 2006, Vol. 22, no. 2, pp. 158-168.

13. Wilcken B., Wiley V. Newborn screening. Pathology, 2008, Vol. 40, no. 2, pp. 104-115.