Сравнительный анализ наборов реагентов для выделения ДНК из сухих пятен крови

Неонатальный скрининг – обязательная процедура обследования новорожденных, которая позволяет выявить наличие генетических заболеваний. Для массового обследования детей используют сухие пятна крови. Эта технология является наиболее доступной и удобной для транспортировки и хранения биологического материала. Выделение ДНК – один из важных этапов в молекулярной диагностике, точность которого особенно важна при генетическом анализе. Различные наборы для экстракции ДНК предлагают различные протоколы и реагенты, которые могут отличаться по эффективности и качеству выделения.

Целью нашей работы было проведение сравнительного анализа наборов реагентов для экстракции ДНК из сухих пятен крови.

Материалом служили образцы сухой капли крови на картах Гатри, полученные от здоровых доношенных младенцев на 3-4 день жизни в рамках программы скрининга новорожденных.

Методы исследования включали спектрофотометрический анализ для определения концентрации и чистоты ДНК, оценивали также простоту протоколов, продолжительность выделения, возможность автоматизации процесса. Контроль эффективности экстракции ДНК разными наборами реагентов дополнительно осуществляли по результатам ПЦР в режиме реального времени с применением тест-системы для оценки уровней TREC и KREC в периферической крови, так как количественный анализ требует большей внимательности к исследуемому материалу.

При оценке чистоты НК, экстрагированных с использованием всех четырех анализируемых наборов, можно было наблюдать успешную депротеинизацию образцов ДНК и относительную чистоту. Средняя чистота ДНК для набора «Экстра-ДНК-Био»  составила  2,2±0,23,  для  «ЭКСТРА-преп PS» – 1,89±0,23, для «МагноПрайм ЮНИ» при ручном и автоматическом выделении – 2,31±0,21 и 2,85±0,09 соответственно. Средняя концентрация ДНК для набора «Экстра-ДНК-Био» составила 15,28 мкг/мл, для «ЭКСТРА-преп PS» – 16,26 мкг/мл, для «МагноПрайм ЮНИ» при ручном и автоматическом выделении – 62,5 мкг/мл и 102,28 мкг/мл, соответственно. Согласно примененному критерию Краскела–Уоллиса и тесту Данна, значимые различия и по параметру TREC, и по параметру KREC присутствуют между группой образцов ДНК, экстрагированных с использованием набора реагентов «МагноПрайм ЮНИ» при ручном выделении, с группами образцов, экстрагированных другими способами («МагноПрайм ЮНИ» при автоматическом выделении) или наборами «Экстра-ДНК-Био» и «ЭКСТРА-преп PS».

В ходе настоящего исследования четыре сравниваемых набора реагентов продемонстрировали высокий уровень сходимости полученных данных, удовлетворяя всем необходимым параметрам для проведения дальнейшего молекулярно-генетического анализа, могут быть использованы для неонатального скрининга и в других областях исследований, требующих экстракции ДНК из сухой капли крови.

1. Аукенов Н.Е., Масабаева М.Р., Хасанова У.У. Выделение и очистка нуклеиновых кислот. Состояние проблемы на современном этапе // Наука и здравоохранение, 2014. № 1. С. 51-53.

2. Воронин С.В., Куцев С.И. Неонатальный скрининг на наследственные заболевания в России: вчера, сегодня, завтра // Неонатология: Новости. Мнения. Обучение, 2022. Т. 10, № 4. С. 34-39.

3. Габдуллина Д.М., Усенова О.П., Моренко М.А., Ковзель Е.Ф. Первичные иммунодефициты: современные подходы в диагностике и терапии // Клиническая медицина Казахстана, 2016. № 1. С. 12-15.

4. Григорьев К.И., Харитонова Л.А., Радзинский В.Е., Папышева О.В., Котайш Г.А. Перинатальная медицина и проблемы неонатального скрининга // Медицинская сестра, 2017. № 4. С. 3-9.

5. Дерябина С.С., Тузанкина И.А., Власова Е.В., Болков М.А., Шершнёв В.Н. Неонатальный скрининг на тяжелую комбинированную иммунную недостаточность в России: прекрасное далеко или завтрашняя реальность? // Вопросы современной педиатрии, 2017. Т. 16, № 1. С. 59-66.

6. Долудин Ю.В., Лимонова А.С., Козлова В.А., Ефимова И.А., Борисова А.Л., Мешков А.Н., Покровская М.С., Драпкина О.М. Сбор и хранение ДНК-содержащего биоматериала и выделенной ДНК // Кардиоваскулярная терапия и профилактика, 2020. Т. 19, № 6. С. 196-204.

7. Карева М.А., Орлова Е.М. Адреногенитальный синдром: прошлое, настоящее и будущее // Проблемы эндокринологии, 2011. Т. 57, №. 1. С. 66-70.

8. Лепесова М.М., Ушакова Т.С., Мырзалива Б.Д. Дифференциальная диагностика спинальной мышечной амиотрофии первого типа // Наука о жизни и здоровье, 2016. № 1. С. 38-46.

9. Никифорова А.И., Абрамов Д.Д., Зобкова Г.Ю., Горяинова А.В., Семыкин С.Ю., Шубина Е., Донников А.Е., Трофимов Д.Ю. Определение мутаций гена CFTR у детей с муковисцидозом // Вестник Российского государственного медицинского университета, 2018. № 3. С. 35-41.

10. Образцов И.В., Фёдорова Л.А., Продеус А.П., Кудлай Д.А., Корсунский И.А. Референсные значения концентрации TREC и KREC у детей и подростков в возрасте 1-17 лет // Педиатрия им. Г. Н. Сперанского, 2021. Т.100, № 6. С. 38-45.

11. Петеркова В.А., Безлепкина О.Б., Ширяева Т.Ю., Вадина Т.А., Нагаева Е.В., Чикулаева О.А., Шредер Е.В., Конюхова М.Б., Макрецкая Н.А., Шестопалова Е.А., Митькина В.Б. Клинические рекомендации «Врожденный гипотиреоз» // Проблемы эндокринологии, 2022. Т. 68, № 2. С. 90-103.

12. Ребриков Д.В., Трофимов Д.Ю. ПЦР «В реальном времени»: подходы к анализу данных (обзор) // Прикладная биохимия и микробиология, 2006. Т. 42, № 5. С. 520-528.

13. Сайтгалина М.А., Останкова Ю.В., Любимова Н.Е., Семенов А.В., Кузнецова Р.Н., Тотолян А.А. Модифицированный метод количественного определения уровней TREC и KREC в периферической крови у больных с иммунодефицитными состояниями // Инфекция и иммунитет, 2022. Т. 12, № 5. С. 981-996. doi: 10.15789/2220-7619-MMF-2039.

14. Anderson S. GALT deficiency galactosemia. MCN Am. J. Matern. Child Nurs., 2018, Vol. 43, no. 1, pp. 44-51.

15. Choi E.H., Lee S.K., Ihm C., Sohn Y.H. Rapid DNA extraction from dried blood spots on filter paper: potential applications in biobanking. Osong Public Health and Res. Perspect., 2014, Vol. 5, no. 6, pp. 351-357.

16. Lucena-Aguilar G., Sanchez-Lopez A.M., Barberan-Aceituno C., Carrillo-Ávila J.A., Lopez-Guerrero J.A., Aguilar-Quesada R. DNA Source Selection for Downstream Applications Based on DNA Quality Indicators Analysis. Biopreserv. Biobank., 2016, Vol. 14, no. 4, pp. 264-270.

17. Mas S., Crescenti A., Gasso P., Vidal-Taboada J.M., Lafuente A. DNA cards: determinants of DNA yield and quality in collecting genetic samples for pharmacogenetic studies. Basic Clin. Pharmacol. Toxicol., 2007, Vol. 101, no. 2, pp. 132-137.

18. Nikiforova A.I., Abramov D.D., Kadochnikova V.V., Zobkova G.U., Ogurtsova K.A., Brjuhanova N.O., Shestopalova E.A., Kochetkova T.O., Shubina E.S., Donnikov A.E., Trofimov D.Y. Determining the frequency of PAH mutations in Moscow region residents with phenylketonuria using a combination of real-time PCR and next-generation sequencing. Bulletin of Russian State Medical University, 2017, no. 4, pp. 38-44.