NK-клетки человека интернализуют рекомбинантный основной стресс-индуцируемый белок HSP70

Одной из основных функций белков теплового шока семейства 70 кДа (HSP70) является защита внутриклеточных протеинов от повреждающих воздействий стрессирующих факторов различной природы. Наряду с этим HSP7070 играют важную роль в жизнедеятельности клеток и в нормальных физиологических условиях, выполняя вспомогательные, так называемые шаперонные функции. Эти упомянутые функции реализуются во внутриклеточном пространстве; однако в некоторых случаях эти белки также обнаруживаются на клеточной поверхности и во внеклеточной среде. Причины и механизмы такой транслокации на клеточную поверхность и секреции HSP70 во внеклеточное пространство еще недостаточно изучены. Вместе с тем показано, что такая необычная внеклеточная локализация HSP70 активирует клетки иммунной системы. Поверхностные HSP70 и их внеклеточный пул стимулируют цитотоксическую активность, в том числе NK-клеток. Однако прямых экспериментальных доказательств возможности интернализации белков HSP70 NK-клетками еще не было продемонстрировано. В данной работе представлены результаты взаимодействия внеклеточного пула HSP70 с NK-клетками периферической крови здоровых доноров. Результаты исследования подтвердили возможность интернализации экзогенных молекул HSP70 NK-клетками. С этой целью нами были получены флуоресцентно меченые молекулы рекомбинантного стресс-индуцируемого HSP70 человека. О связывании HSP70 с флуорохромом свидетельствовала флуоресценция полученного конъюгата при воздействии освещения с длиной волны 488 нм. Данные электрофореза свидетельствовали об отсутствии деградации белка в процессе мечения, чистоте и стабильности модифицированного белка. Для оценки взаимодействия HSP70 с NK-клетками флуоресцентно меченый HSP70 добавляли к культуре NK-клеток in vitro, выделенных методом магнитной сепарации из мононуклеарной фракции периферической крови, и анализировали с помощью конфокальной микроскопии. Этот анализ показал, что живые NK-клетки интернализуют внеклеточные HSP70, которые локализуются как в лизосомах, так и в фагосомах. Наши эксперименты впервые иллюстрируют процесс проникновения внеклеточных HSP70 в эти клетки. Полученные результаты позволяют предположить, что активация NK-клеток под действием экзогенного HSP70 может быть связана в том числе и с интернализацией этих белков.

1. Arispe N., Doh M., Simakova O., Kurganov B., de Maio A. Hsc70 and HSP70 interact with phosphatidylserine on the surface of PC12 cells resulting in a decrease of viability. FASEB J., 2004, Vol. 18, no. 14, pp. 1636-1345.

2. Evgen’ev M., Bobkova N., Krasnov G., Garbuz D., Funikov S., Kudryavtseva A., Kulikov A., Samokhin A., Maltsev A., Nesterova I. The Effect of Human HSP70 Administration on a Mouse Model of Alzheimer’s Disease Strongly Depends on Transgenicity and Age. J. Alzheimers Dis., 2019, Vol. 67, no. 4, pp.1391-1404.

3. Gurskiy Y.G., Garbuz D.G., Soshnikova N.V., Krasnov A.N., Deikin A., Lazarev V.F., Sverchinskyi D., Margulis B.A., Zatsepina O.G., Karpov V.L., Belzhelarskaya S.N., Feoktistova E., Georgieva S.G., Evgen’ev M.B. The development of modified human HSP70 (HSPA1A) and its production in the milk of transgenic mice. Cell Stress Chaperones, 2016, Vol. 21, no. 6, pp. 1055-1064.

4. Guzhova I., Kislyakova K., Moskaliova O., Fridlanskaya I., Tytell M., Cheetham M., Margulis B. In vitro studies show that HSP70 can be released by glia and that exogenous HSP70 can enhance neuronal stress tolerance. Brain Res,. 2001, Vol. 914, no. 1-2, pp. 66-73.

5. Guzhova I.V., Arnholdt A.C., Darieva Z.A., Kinev A.V., Lasunskaia E.B., Nilsson K., Bozhkov V.M., Voronin A.P., Margulis B.A. Effects of exogenous stress protein 70 on the functional properties of human promonocytes through binding to cell surface and internalization. Cell Stress Chaperones, 1998, Vol. 3, no. 1, pp. 67-77.

6. Hunter-Lavin C., Davies E.L., Bacelar M.M., Marshall M.J., Andrew S.M., Williams J.H. HSP70 release from peripheral blood mononuclear cells. Biochem. Biophys. Res. Commun., 2004, Vol. 324, no. 2, pp. 511-517.

7. Johnson J.D., Fleshner M. Releasing signals, secretory pathways, and immune function of endogenous extracellular heat shock protein 72. J. Leukoc. Biol, 2006, Vol. 79, pp. 425-434.

8. Moseley P.L. Heat shock proteins and the inflammatory response. Ann. N. Y. Acad. Sci., 1998, Vol. 856, pp. 206-213.

9. Multhoff G. Activation of natural killer cells by heat shock protein 70. Int. J. Hyperthermia, 2002, Vol. 18, no. 6, pp. 576-585.

10. Njemini R., Bautmans I., Onyema O.O., van Puyvelde K., Demanet C., Mets T. Circulating Heat Shock protein 70 in health, aging and disease. BMC Immunol., 2011, Vol. 12, 24. doi: 10.1186/1471-2172-12-24.

11. Pockley A.G. Heat shock proteins in health and disease: therapeutic targets or therapeutic agents? Exp. Rev. Mol. Med., 2001, Vol. 21, pp. 1-21.

12. Shevtsov M., Pitkin E., Ischenko A., Stangl S., Khachatryan W., Galibin O., Edmond S., Lobinger D., Multhoff G. Ex vivo HSP70-Activated NK Cells in Combination With PD-1 Inhibition Significantly Increase Overall Survival in Preclinical Models of Glioblastoma and Lung Cancer. Front. Immunol., 2019, Vol. 10, 454. doi: 10.3389/fimmu.2019.00454.

13. Srivastava P. Roles of heat-shock proteins in innate and adaptive immunity. Nat. Rev. Immunol., 2002, Vol. 2, no. 3, pp. 185-194.

14. Tsan M.F., Gao B. Cytokine function of heat shock proteins. Am. J. Physiol. Cell Physiol., 2004, Vol. 286, no. 4, pp. C739-C744.

15. Yurinskaya M., Zatsepina O.G., Vinokurov M.G., Bobkova N.V., Garbuz D.G., Morozov A.V., Kulikova D.A., Mitkevich V.A., Makarov A.A., Funikov S.Yu., Evgen’ev M.B. The fate of exogenous human HSP70 introduced into animal cells by different means. Curr. Drug Deliv., 2015, Vol. 12, no. 5, pp. 524-532.