НОВЫЙ МЕТОД, БАЗИРУЮЩИЙСЯ НА ИСПОЛЬЗОВАНИИ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ ОДНОДОМЕННЫХ АНТИТЕЛ ДЛЯ УДАЛЕНИЯ ОПРЕДЕЛЕННЫХ МАЖОРНЫХ БЕЛКОВ ИЗ ПЛАЗМЫ КРОВИ, СПОСОБСТВУЕТ УМЕНЬШЕНИЮ НЕСПЕЦИФИЧЕСКОГО СИГНАЛА В ИММУНОАНАЛИЗЕ

Ахиллесовой пятой иммуноанализа является порой недооцениваемая проблема его восприимчивости к различным интерференциям (помехам, вмешательствам в анализ). Присутствие в пробе пациента мешающих веществ может привести к ошибочному результату теста, следствием чего может стать неправильная диагностика и катастрофические последствия для пациента, поэтому следует уделять особое внимание выявлению возможных интерференций в используемых тест-системах и при возможности разрабатывать и применять методы их преодоления. Особенно остро вопрос борьбы с интерференциями стоит в случае иммуноанализа биомаркеров в плазме или сыворотке крови человека. Для уменьшения возможных интерференций желательно было бы иметь возможность специфичной и адаптируемой предобработки препаратов крови для конкретного анализируемого маркерного белка, для конкретной тест-системы. Мы предполагаем, что такую предобработку можно сделать с помощью комбинирования иммуносорбентов, базирующихся на использовании особых однодоменных антител (нанотел). Нанотела – рекомбинантные белки, производные однодоменных антиген-узнающих вариабельных фрагменов особых антител, состоящих из димера укороченных тяжелых цепей при полном отсутствии легких цепей. Такие особые антитела присутствуют в норме, наряду с обычными антителами, у представителей семейства Camelidae (Верблюдовые) и у некоторых видов хрящевых рыб. Особые свойства нанотел могут обеспечить определенные преимущества при их использовании по сравнению с антителами традиционной структуры и их производными. В данной работе впервые показано, что иммуносорбенты на основе определенной комбинации используемых в качестве лигандов однодоменных антител, способных специфически связывать (и удалять) конкретные мажорные белки крови человека, могут быть подобраны для заданного маркерного антигена крови таким образом, что будут эффективным инструментом предобработки крови с целью уменьшения возможных эффектов интерференции и повышения чувствительности при диагностическом иммуноферментном анализе «сэндвич»-типа. Новый метод предобработки плазмы крови продемонстрирован на примере препаратов плазмы крови (в разведении 1:40) двух пациентов. Ранее разработанная модельная система детекции белка лактоферрина была использована для анализа образцов плазмы крови. Показано, что можно существенно повысить соотношение суммарного детектируемого сигнала к неспецифическому фону, связанному с интерференциями, за счет сильного уменьшения этого фона путем аффинного удаления (с помощью соответствующих иммобилизованных однодоменных антител) из препаратов плазмы крови фракции трех мажорных белков: фибриногена, иммуноглобулинов класса G, альфа-2-макроглобулина.

1. Горяйнова О.С., Иванова Т.И., Рутовская М.В., Тиллиб С.В. Метод параллельного и последовательного генерирования однодоменных антител для протеомного анализа плазмы крови человека // Молекулярная биология, 2017. Т. 51. № 6. С. 985-996.

2. Тиллиб С.В., Вятчанин А.С., Муилдерманс С. Молекулярный анализ структуры особых антител Сamelus bactrianus, состоящих только из тяжелых цепей // Биохимия, 2014. Т. 79. № 12. С. 1687-1697.

3. Boehm Т.К., Sojar Н., DeNardin E. Concentration-dependent effect of fibrinogen on IgG-specific antigen binding and phagocytosis. Cell. Immunol., 2010, Vol. 263, no. 1, pp. 41-48.

4. Bolstad N., Warren D.J., Nustad K. Heterophilic antibody interference in immunometric assays. Best Pract. Res. Clin. Endocrinol. Metab., 2013, Vol. 27, pp. 647-661.

5. Hamers-Casterman C., Atarhouch T., Muyldermans S., Naturally occurring antibodies devoid of light chains. Nature, 1993, Vol. 363, pp. 446-448.

6. Harmsen M.M., de Haard H.J. Properties, production, and applications of camelid single-domain antibody fragments. Appl. Microbiol. Biotechnol., 2007, Vol. 77, pp. 13-22.

7. Moreno-Expósito L., Illescas-Montes R., Melguizo-Rodrígueza L. Multifunctional capacity and therapeutic potential of lactoferrin. Life Sciences, 2018, Vol. 195, pp. 61-64.

8. Muyldermans S., Baral T.N., Retamozzo V.C. Camelid immunoglobulins and nanobody technology. Vet . Immunol. Immunopathol., 2009, Vol. 128, pp. 178-183.

9. Muyldermans S. Nanobodies: natural single-domain antibodies. Annu. Rev. Biochem., 2013, Vol. 82, pp. 775-797.

10. Steeland S., Vandenbroucke R.E., Libert C. Nanobodies as therapeutics: big opportunities for small antibodies. Drug Discovery Today., 2016, Vol. 21, pp. 1077-1113.

11. Tillib S.V., Privezentseva M.E., Ivanova T.I. Single-domain antibody-based ligands for immunoaffinity separation of recombinant human lactoferrin from the goat lactoferrin of trasgenic goat milk. J. Chromatogr. B: Anal. Technol. Biomed. Life Sci. 2014, pp. 48-57, 949-950.

12. Ward G., Simpson A., Boscato L., Hickman P. E. The investigation of interferences in immunoassay. Clin. Biochem., 2017, Vol. 50, pp. 1306-1311.

13. Wyatt A.R., Kumita J.R., Farrawell N/. Alpha-2-macroglobulin is acutely sensitive to freezing and lyophilization: Implications for structural and functional studies. PLoS ONE, 2015, Vol. 10, no. 6, e0130036. doi: 10.7868/S0026898417060106.