mimmunМедицинская иммунологияMedical Immunology (Russia)1563-06252313-741XSPb RAACI10.15789/1563-0625-2016-2-139-150mimmun-997Research ArticleОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИORIGINAL ARTICLESОПРЕДЕЛЕНИЕ УРОВНЯ ЭКСПРЕССИИ мРНК СПЛАЙСИРОВАННЫХ ВАРИАНТОВ DR3 В КРОВИ ПРИ ИНФЕКЦИОННОМ МОНОНУКЛЕОЗЕDETERMINATION OF LEVEL EXPRESSION OF mRNA SPLICING VARIANTS FOR DR3 IN BLOOD CELLS IN INFECTIOUS MONONUCLEOSISЦветковаВ. Д.CvetkovaV. D.

младший научный сотрудник лаборатории молекулярной биологии и биотехнологии,

603950, г. Нижний Новгород, ул. Малая Ямская, 71

Junior Research Associate, Laboratory of Molecular Biology and Biotechnology,

603950, Nizhny Novgorod, Malaya Yamskaya str., 71

starikova@nniiem.ruСахарновН. А.SakharnovN. A.

научный сотрудник лаборатории молекулярной биологии и биотехнологии,

г. Нижний Новгород

Research Associate, Laboratory of Molecular Biology and Biotechnology,

 Nizhny Novgorod

КнязевД. И.KnyazevD. I.

к.б.н., старший научный сотрудник лаборатории молекулярной биологии и биотехнологии,

г. Нижний Новгород

PhD (Biology), Senior Research Associate, Laboratory of Molecular Biology and Biotechnology,

 Nizhny Novgorod

УткинО. В.UtkinO. V.

к.б.н., заведующий лабораторией молекулярной биологии и биотехнологии,

г. Нижний Новгород

PhD (Biology), Head, Laboratory of Molecular Biology and Biotechnology,

 Nizhny Novgorod

НеумоинаН. В.NeumoinaN. V.

к.м.н., главный врач клиники инфекционных болезней,

г. Нижний Новгород

PhD (Medicine), Medical Director, Clinics of Infectious Diseases,

 Nizhny Novgorod

БруснигинаН. Ф.BrusniginaN. F.

к.м.н., доцент, заведующий лабораторией метагеномики и молекулярной индикации патогенов,

г. Нижний Новгород

PhD (Medicine), Associate Professor, Head, Laboratory of Metagenomics and Molecular Detection of Pathogens,

 Nizhny Novgorod

ФБУН «Нижегородский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной» РоспотребнадзораРоссияI.N. Blokhina Research Institute of Epidemiology and MicrobiologyRussian FederationФБУН «Нижегородский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной» Роспотребнадзора; ГБОУ ВПО «Нижегородская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения РФРоссияI.N. Blokhina Research Institute of Epidemiology and Microbiology; Nizhny Novgorod State Medical Academy, Ministry of Healthcare of the Russian FederationRussian Federation201614042016182139150Copyright © Цветкова В.Д., Сахарнов Н.А., Князев Д.И., Уткин О.В., Неумоина Н.В., Бруснигина Н.Ф., 20162016Цветкова В.Д., Сахарнов Н.А., Князев Д.И., Уткин О.В., Неумоина Н.В., Бруснигина Н.Ф.Cvetkova V.D., Sakharnov N.A., Knyazev D.I., Utkin O.V., Neumoina N.V., Brusnigina N.F.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.mimmun.ru/mimmun/article/view/997

«Рецептор смерти» DR3 играет важную роль в инициации апоптоза, пролиферации или воспаления. Показано участие данного рецептора в различных заболеваниях, в том числе инфекционной природы. В результате альтернативного сплайсинга образуется множество вариантов мРНК DR3, кодирующих мембранные и растворимые формы рецептора с различными функциями. Особенности экспрессии, а также вклад отдельных вариантов DR3 в иммунопатогенез инфекционного мононуклеоза (ИМ) практически не изучены.

Целью настоящей работы явилась разработка, валидация и апробация способов оценки уровня экспрессии и встречаемости сплайсированных вариантов мРНК DR3 в крови с помощью ОТ-ПЦР в реальном времени (ОТ-ПЦР-РВ) и ОТ-ПЦР при ИМ.

Разработанный вариант ОТ-ПЦР-РВ позволил специфично и чувствительно (лимит полуколичественной детекции = 34-35 циклов) определять относительное количество мРНК пула форм DR3, мембранных вариантов DR3 (LARD1a + LARD8), а также долю мРНК мембранных и растворимых форм рецептора у здоровых волонтеров и пациентов с острым инфекционным мононуклеозом (ОИМ). Показана низкая экспрессия в крови мРНК двух альтернативных мембранных вариантов DR3 – LARD1b и DR3beta, что позволяет отнести данные варианты к минорным формам. Обнаружено снижение относительного уровня экспрессии мРНК пула форм DR3 у пациентов с ОИМ по сравнению с условно здоровыми волонтерами на фоне отсутствия различий в экспрессии мРНК мембранных вариантов рецептора.

Для определения качественного вклада в экспрессию мембранных вариантов каждой из форм LARD1a и LARD8 был разработан двухраундовый «гнездовой» вариант ОТ-ПЦР. Показано, что в большинстве образцов здоровых волонтеров и пациентов с ОИМ в экспрессию мРНК мембранных вариантов DR3 вносят свой вклад как основная мембранная LARD1a, так и альтернативная LARD8 формы рецептора.

Разработанные способы оценки уровня экспрессии и встречаемости мРНК DR3 позволяют комплексно охарактеризовать изменения в экспрессии и функционировании данного рецептора, вызванные ИМ. В рамках развития данной работы требуется дальнейшая апробация методики на выборках большего объема.

The DR3 «death receptor» plays an important role in the initiation of apoptosis, proliferation, or inflammation. This receptor is shown to be involved in various diseases, including infectious conditions. Different variants of mRNA DR3 are formed as a result of alternative splicing. These variant transcripts encode membrane and soluble forms of the receptor which have different functions. Features of their expression and contribution of individual DR3 variants to the immune pathogenesis of infectious mononucleosis (IM) are poorely understood.

The purpose of this work was to develop, validate and test the techniques of DR3 gene expression assays, as well as to evaluate the DR3 mRNA splice variants by means of real-time RT-PCR and RT-PCR in the IM patients.

The original version of real-time RT-PCR allowed to determine relative amounts of DR3 mRNA, DR3 membrane variants (LARD1a + LARD8), and ratios of mRNAs encoding membrane and soluble forms of the receptor. The technique proved to be specific and sensitive (a semi-quantitative detection limit = 34-35 cycles) when tested in healthy volunteers and patients with acute infectious mononucleosis (AIM). Lower expression levels were shown for two alternative membrane variants of DR3 mRNA (LARD1b and DR3beta) thus regarding these isoforms as minor fractions. The relative levels of total DR3 mRNA expression were decreased in patients with AIM, as compared to healthy volunteers, whereas mRNA expression of membrane receptor variants did not differ between IM and controls.

To determine a qualitative contribution of either LARD1a and LARD8 variants into the expression of membrane forms of DR3, a two-step «nested» version of RT-PCR has been developed. It was shown that, in majority of control and IM samples, both main LARD1a, and alternative LARD8 membrane forms are contributing to mRNA expression of membrane DR3 variants.

The presented methods for evaluation of expression and occurrence of DR3 mRNA variants allow to characterize changes in the expression and function of this receptor associated with infectious mononucleosis. Further investigations are required to test the technique in larger number of samples.

DR3/LARDальтернативный сплайсингсплайсированные вариантыинфекционный мононуклеозПЦР в реальном времениDR3/LARDalternative splicingmRNA variantsinfectious mononucleosisreal-time PCRReferencesУткин О.В., Новиков В.В. Рецепторы смерти в модуляции апоптоза // Успехи современной биологии, 2012. Т. 132, №4. С. 381-390. [Utkin O.V., Novikov V.V. Death receptors in modulation of apoptosis. Uspekhi sovremennoy biologii = Biology Bulletin Reviews, 2012, Vol. 132, no. 4, pp. 381-390. (In Russ.)]Уткин О.В., Новиков В.В. Рецепторы смерти в модуляции апоптоза // Успехи современной биологии, 2012. Т. 132, №4. С. 381-390. [Utkin O.V., Novikov V.V. Death receptors in modulation of apoptosis. Uspekhi sovremennoy biologii = Biology Bulletin Reviews, 2012, Vol. 132, no. 4, pp. 381-390. (In Russ.)]Уткин О.В., Старикова, В.Д., Новиков В.В. Встречаемость сплайсированных вариантов матричной РНК DR3/LARD при герпесвирусной инфекции // Вопросы вирусологии, 2014. Т. 59, № 6. С. 36-38. [Utkin O.V., Starikova V.D., Novikov V.V. Frequency of occurrence spliced variants of messenger RNA DR3/LARD at herpesviral infection. Voprosy virusologii = Problems of Virology, 2014, Vol. 59, no. 6, pp. 36-38. (In Russ.)]Уткин О.В., Старикова, В.Д., Новиков В.В. Встречаемость сплайсированных вариантов матричной РНК DR3/LARD при герпесвирусной инфекции // Вопросы вирусологии, 2014. Т. 59, № 6. С. 36-38. [Utkin O.V., Starikova V.D., Novikov V.V. Frequency of occurrence spliced variants of messenger RNA DR3/LARD at herpesviral infection. Voprosy virusologii = Problems of Virology, 2014, Vol. 59, no. 6, pp. 36-38. (In Russ.)]Bamias G., Mishina M., Nyce M. Ross W.G., Kollias G., Rivera-Nieves J., Pizarro T.T., Cominelli F. Role of TL1A and its receptor DR3 in two models of chronic murine ileitis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2006, Vol. 103, no. 22, pp. 8441-8446.Bamias G., Mishina M., Nyce M. Ross W.G., Kollias G., Rivera-Nieves J., Pizarro T.T., Cominelli F. Role of TL1A and its receptor DR3 in two models of chronic murine ileitis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2006, Vol. 103, no. 22, pp. 8441-8446.Borysenko C.W., A-Palacios V.N.G., Griswold R.D. Li Y., Iyer A.K., Yaroslavskiy B.B., Sharrow A.C., Blair H.C. Death Receptor-3 Mediates Apoptosis in Human Osteoblasts Under Narrowly Regulated Conditions. J. Cell. Physiol., 2006, Vol. 209, no. 3, pp. 1021-1028.Borysenko C.W., A-Palacios V.N.G., Griswold R.D. Li Y., Iyer A.K., Yaroslavskiy B.B., Sharrow A.C., Blair H.C. Death Receptor-3 Mediates Apoptosis in Human Osteoblasts Under Narrowly Regulated Conditions. J. Cell. Physiol., 2006, Vol. 209, no. 3, pp. 1021-1028.Buchan S.L., Taraban V.Y., Slebioda T.J., James S., Cunningham A.F, Al-Shamkhani A. Death receptor 3 is essential for generating optimal protective CD4+ T-cell immunity against Salmonella. Eur. J. Immunol., 2012, Vol. 42, no. 3, pp. 580-588.Buchan S.L., Taraban V.Y., Slebioda T.J., James S., Cunningham A.F, Al-Shamkhani A. Death receptor 3 is essential for generating optimal protective CD4+ T-cell immunity against Salmonella. Eur. J. Immunol., 2012, Vol. 42, no. 3, pp. 580-588.Chomczynski P., Sacchi N. The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenolchloroform extraction: twenty-something years on. Nat. Protoc., 2006, Vol. 1, no. 2, pp. 581-585.Chomczynski P., Sacchi N. The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenolchloroform extraction: twenty-something years on. Nat. Protoc., 2006, Vol. 1, no. 2, pp. 581-585.Meylan F., Richard A.C., Siegel R.M. TL1A and DR3, a TNF family ligand-receptor pair that promotes lymphocyte costimulation, mucosal hyperplasia, and autoimmune inflammation. Immunol Rev., 2011, Vol. 244, no. 1, pp. 188-196.Meylan F., Richard A.C., Siegel R.M. TL1A and DR3, a TNF family ligand-receptor pair that promotes lymphocyte costimulation, mucosal hyperplasia, and autoimmune inflammation. Immunol Rev., 2011, Vol. 244, no. 1, pp. 188-196.Pappu B.P., Borodovsky A., Zheng T.S., Yang X.,Wu P., Dong X., Weng S., Browning B., Scott M.L., Ma L., Su L., Tian Q., Schneider P., Flavell R.A., Dong C., Burkly L.C. TL1A–DR3 interaction regulates Th17 cell function and Th17-mediated autoimmune disease. J. Exp. Med., 2008, Vol. 205, no. 5, pp. 1049-1062.Pappu B.P., Borodovsky A., Zheng T.S., Yang X.,Wu P., Dong X., Weng S., Browning B., Scott M.L., Ma L., Su L., Tian Q., Schneider P., Flavell R.A., Dong C., Burkly L.C. TL1A–DR3 interaction regulates Th17 cell function and Th17-mediated autoimmune disease. J. Exp. Med., 2008, Vol. 205, no. 5, pp. 1049-1062.Porquet N., Poirier A., Houle F., Pin A-L.,Gout S.,Tremblay P-L., Paquet E.R., Klinck R., Auger F.A., Huot J. Survival advantages conferred to colon cancer cells by E-selectin-induced activation of the PI3K-NFκB survival axis downstream of Death receptor-3. BMC Cancer., 2011, Vol. 11, p. 285.Porquet N., Poirier A., Houle F., Pin A-L.,Gout S.,Tremblay P-L., Paquet E.R., Klinck R., Auger F.A., Huot J. Survival advantages conferred to colon cancer cells by E-selectin-induced activation of the PI3K-NFκB survival axis downstream of Death receptor-3. BMC Cancer., 2011, Vol. 11, p. 285.Qin T. Upregulation of DR3 expression in CD4+ T cells promotes secretion of IL-17 in experimental autoimmune uveitis. Mol. Vis., 2011, Vol. 17, pp. 3486-3493.Qin T. Upregulation of DR3 expression in CD4+ T cells promotes secretion of IL-17 in experimental autoimmune uveitis. Mol. Vis., 2011, Vol. 17, pp. 3486-3493.Screaton G.R., Xu X.N., Olsen A.L. Cowper A.E, Tan R., McMichael A.J. et al. LARD: A new lymphoidspecific death domain containing receptor regulated by alternative pre-mRNA splicing. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, Vol. 94, no. 9, pp. 4615-4619.Screaton G.R., Xu X.N., Olsen A.L. Cowper A.E, Tan R., McMichael A.J. et al. LARD: A new lymphoidspecific death domain containing receptor regulated by alternative pre-mRNA splicing. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, Vol. 94, no. 9, pp. 4615-4619.Sessler T., Healy S., Samali A., Szegezdi E. Structural determinants of DISC function: new insights into death receptor-mediated apoptosis signalling. Pharmacol. Ther., 2013, Vol. 140, pp. 186-199.Sessler T., Healy S., Samali A., Szegezdi E. Structural determinants of DISC function: new insights into death receptor-mediated apoptosis signalling. Pharmacol. Ther., 2013, Vol. 140, pp. 186-199.Stamova B.S., Apperson M., Walker W.L., Tian Y., Xu H., Adamczy P., Zhan X., Liu D.Z., Ander B.P., Liao I.H., Gregg J.P., Turner R.J., Jickling G., Lit L., Sharp F.R. Identification and validation of suitable endogenous reference genes for gene expression studies in human peripheral blood. BMC Medical Genomics., 2009, Vol. 2, p. 49.Stamova B.S., Apperson M., Walker W.L., Tian Y., Xu H., Adamczy P., Zhan X., Liu D.Z., Ander B.P., Liao I.H., Gregg J.P., Turner R.J., Jickling G., Lit L., Sharp F.R. Identification and validation of suitable endogenous reference genes for gene expression studies in human peripheral blood. BMC Medical Genomics., 2009, Vol. 2, p. 49.Twohig J.P., Marsden M., Cuff S.M., Ferdinand J.R., Gallimore A.M., Perks W.V., Al-Shamkhani A., Humphreys I.R., Wang E.C. The death receptor 3/TL1A pathway is essential for efficient development of antiviral CD4+ and CD8+ T-cell immunity. FASEB J., 2012, Vol. 26, no. 8, pp. 3575-3586.Twohig J.P., Marsden M., Cuff S.M., Ferdinand J.R., Gallimore A.M., Perks W.V., Al-Shamkhani A., Humphreys I.R., Wang E.C. The death receptor 3/TL1A pathway is essential for efficient development of antiviral CD4+ and CD8+ T-cell immunity. FASEB J., 2012, Vol. 26, no. 8, pp. 3575-3586.Van de Berg P.J., Yong S.L., Remmerswaal E.B., van Lier R.A., ten Berge I.J. Cytomegalovirus-induced effector T cells cause endothelial cell damage. Clin. Vaccine Immunol., 2012, Vol. 19, no. 5, pp. 772-779.Van de Berg P.J., Yong S.L., Remmerswaal E.B., van Lier R.A., ten Berge I.J. Cytomegalovirus-induced effector T cells cause endothelial cell damage. Clin. Vaccine Immunol., 2012, Vol. 19, no. 5, pp. 772-779.Wang J.J., Li Y.F., Jin Y.Y. Wang X., Chen T.X. Effects of Epstein–Barr virus on the development of dendritic cells derived from cord blood monocytes: an essential role for apoptosis. Braz. J. Infect. Dis., 2012, Vol. 16, no. 1, pp. 19-26.Wang J.J., Li Y.F., Jin Y.Y. Wang X., Chen T.X. Effects of Epstein–Barr virus on the development of dendritic cells derived from cord blood monocytes: an essential role for apoptosis. Braz. J. Infect. Dis., 2012, Vol. 16, no. 1, pp. 19-26.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.