mimmunМедицинская иммунологияMedical Immunology (Russia)1563-06252313-741XSPb RAACI10.15789/1563-0625-2015-5-479-488mimmun-936Research ArticleИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫIMMUNOLOGICAL METHODSНОВЫЙ МЕТОД ОЦЕНКИ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ СИСТЕМЫ КОМПЛЕМЕНТАA NEW METHOD TO ASSESS FUNCTIONAL ACTIVITY OF SERUM COMPLEMENT SYSTEMЧеремныхЕ. Г.CheremnykhE. G.

Кандидат технических наук, старший научный сотрудник, лаборатория биохимии

PhD (Technology), Senior Research Associate, Laboratory of Biochemistry

nat_karpova@mail.ruИвановП. А.IvanovP. A.

Кандидат биологических наук, старший научный сотрудник, лаборатория биохимии

PhD (Biology), Senior Research Associate, Laboratory of Biochemistry

nat_karpova@mail.ruФакторМ. И.FaktorM. I.

Кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник, лаборатория биохимии

PhD (Biology), Leading Research Associate, Laboratory of Biochemistry

nat_karpova@mail.ruКарповаН. С.KarpovaN. S.

Младший научный сотрудник, лаборатория биохимии имии

Junior Research Associate, Laboratory of Biochemistry

nat_karpova@mail.ruВасильеваЕ. Ф.VasiljevaE. F.

Кандидат биологических наук, старший научный сотрудник, лаборатория биохимии

PhD (Biology), Senior Research Associate, Laboratory of Biochemistry

nat_karpova@mail.ruГусевК. В.GusevK. V.

Врач клинической лабораторной диагностики

Clinical Chemist (Laboratory Diagnostics), Clinical Laboratory

nat_karpova@mail.ruБрусовО. С.BrusovO. S.

Кандидат биологических наук, заведующий лабораторией биохимии

PhD (Biology), Chief, Laboratory of Biochemistry

nat_karpova@mail.ruНаучный центр психического здоровья, МоскваРоссияResearch Сenter of Mental Health, MoscowRussian FederationПсихиатрическая клиническая больница № 1 им. Н.А. Алексеева, МоскваРоссияN.A. Alekseev Psychiatric Clinical Hospital № 1, MoscowRussian Federation201508102015175479488Copyright © Черемных Е.Г., Иванов П.А., Фактор М.И., Карпова Н.С., Васильева Е.Ф., Гусев К.В., Брусов О.С., 20152015Черемных Е.Г., Иванов П.А., Фактор М.И., Карпова Н.С., Васильева Е.Ф., Гусев К.В., Брусов О.С.Cheremnykh E.G., Ivanov P.A., Faktor M.I., Karpova N.S., Vasiljeva E.F., Gusev K.V., Brusov O.S.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.mimmun.ru/mimmun/article/view/936

Система комплемента является важным компонентом врожденного иммунитета, обеспечивающим первичную защиту против проникающих в организм патогенов. Кроме того, показано, что система комплемента связана со многими заболеваниями, не только аутоиммунными и инфекционными, но и психическими. В связи с этим необходима разработка доступного и быстрого метода определения активности системы комплемента в режиме реального времени. Представлен новый автоматизированный метод оценки функциональной активности системы комплемента (СК), основанный на цитолитическом действии этой системы для инфузорий Tetrahymena pyriformis. Метод состоит в циклическом подсчете живых подвижных клеток с помощью разработанного нами прибора БиоЛаТ, в состав которого входят две видеокамеры, устройства подсветки и перемещения круглого планшета, планшет с двумя рядами лунок, микропроцессорный блок управления. Управляет работой прибора и осуществляет подсчет клеток программа AutoCiliata. Подсчет производится на основе последовательной фиксации двух кадров c дальнейшей программной обработкой изображений. Представлены результаты микроскопических наблюдений процесса гибели клетки в буфере на основе триэтаноламина с 5% концентрацией сыворотки крови, а также результаты сравнения активности СК в различных буферах – среде культивирования инфузорий, веронал-мединаловом буфере и буфере на основе триэтаноламина (ТЭА). Обоснована замена веронал-мединалового буфера на буфер на основе триэтаноламина. Время гибели всех клеток в буфере на основе триэтаноламина с концентрацией сыворотки 5% не превышает 15 минут для всех исследованных сывороток. В качестве величин, характеризующих активность СК, выбраны время гибели половины клеток (ТЛД50) и величина 100 × (1/ТЛД50)% (активность системы комплемента, АСК). Представлены результаты оценки чувствительности метода, на основе зависимостей ТЛД50 и АСК от концентрации сыворотки. Выдвинуто предположение о возможности оценки интегральной активности комплемента и соотношения интенсивностей синтеза и расхода его эффекторных белков. Отражены результаты исследования разного содержания ионов Ca++ и Mg++ в буфере и обоснован выбор их физиологических концентраций,2,5 мМи1,5 мМсоответственно. Оценены статистические характеристики точности аппаратной и методической частей метода, средние коэффициенты вариации составляют 3,9 и 2,7% соответственно, что удовлетворяет требо ваниям надежности результатов исследования, а короткое время исследования доказывает возможность применения метода в клинической практике в онлайн-режиме. Разработан метод полуавтоматического определения функциональной активности сывороточного комплемента, который может быть использован в повседневной клинической практике, том числе в онлайн-режиме. 

Complement system is an important component of innate immunity, providing primary protection against pathogens invading the body. In addition, it was shown that the complement system is associated with many diseases, not only autoimmune and infectious, but also mental disorders. In this regard, it is necessary to develop affordable and fast method of measuring activity of the complement system in real-time mode. We present a new semi-automated method for assessment of serum complement activity. The assay is based on cytolytic action of complement system upon the ciliate organism Tetrahymena pyriformis. This method consists in repeated counting of live Tetrahymena motile cells by means of specially developed Biolat device, which consists of two video cameras, light sources, and movable round plate. The plate has two rows of holes. The device also includes microprocessor control unit based on AutoCiliata software, intended for control of operation module and counting the surviving cell. The calculations are based on fixation of two sequential video-frames, with subsequent software image processing. Cell death events were observed upon incubation in triethanolamine (TEA) buffer containing 5% of blood serum. We have also compared complement activity in different buffers, i.e., standard medium for culturing of ciliates, Veronal-Medinalum buffer, and the TEA buffer. TEA buffer was found superior to the Veronal buffer when applied in the test system. The time of cell death in the TEA-buffered medium containing 5% serum was < 15 minutes for all the sera studied. The parameters denoting serum complement activity were as follows: a half-life time for the moving cells (TLD50), and a similar value for 100% cell inactivation (1/TLD50, functional activity of the complement system, ACS). The sensitivity of this assay was calculated from dependencies between TLD50 and ACS, and actual serum concentrations. We have suggested an opportunity for evaluation of an integral complement activity, and interrelations between the intensity of synthesis and consumption of its major effector proteins. In the course of this study, we have tested different concentrations of Ca++ and Mg++ ions in the incubation buffer, with optimal physiological concentrations of2.5 mMand1.5 mM, respectively. We have also estimated statistical precision characteristics for pre-analytical and analytical steps of the method. The average coefficients of variation (CV) were 3.9% and 2.7%, respectively, thus satisfying the reliability criteria in research. A short performance time of the study suggests its potential application in clinical practice, including online examination regimens. A method for semi-automatic measurement of serum complement activity could be applicable in daily clinical practice, including the online performance.

система комплементаактивность комплементаTetrahymena pyriformisприбор БиоЛаТобработка изображенияподсчет клетокcomplement systemcomplement activityTetrahymena pyriformisBioLat deviceimage processingcell countsReferencesКулешина О.Н., Андина С.С., Попова О.П., Черемных Е.Г., Козлов Л.В. Активность комплемента при коклюше // Эпидемиология и вакцинопрофилактика, 2013. T. 2, № 69. С. 46-51. [Kuleshina O.N., Andina S.S., Popova O.P., Cheremnykh E.G., Kozlov, L.V. Activity of complement in pertussis]. Epidemiologiya i vaktsinoprofilaktika = Epidemiology and Vaccination, 2013, Vol. 2, no. 69, pp. 46-51. (In Russ.)]Кулешина О.Н., Андина С.С., Попова О.П., Черемных Е.Г., Козлов Л.В. Активность комплемента при коклюше // Эпидемиология и вакцинопрофилактика, 2013. T. 2, № 69. С. 46-51. [Kuleshina O.N., Andina S.S., Popova O.P., Cheremnykh E.G., Kozlov, L.V. Activity of complement in pertussis]. Epidemiologiya i vaktsinoprofilaktika = Epidemiology and Vaccination, 2013, Vol. 2, no. 69, pp. 46-51. (In Russ.)]Кулешина О.Н., Козлов Л.В., Черемных Е.Г. Универсальный метод определения функциональной активности комплемента человека, лабораторных, домашних и сельскохозяйственных животных, земноводных и птиц // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2014. T. 157, № 2. C. 254-257. [Kuleshina O.N., Kozlov L.V., Cheremnykh E.G. Universal method for determining the functional activity of the human complement, laboratory, domestic and farm animals, amphibians and birds]. Byulleten eksperimental`noy biologii i meditsiny = Bulletin of Experimental Biology and Medicine, 2014, Vol. 157, no. 2, pp. 254-257. (In Russ.)]Кулешина О.Н., Козлов Л.В., Черемных Е.Г. Универсальный метод определения функциональной активности комплемента человека, лабораторных, домашних и сельскохозяйственных животных, земноводных и птиц // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2014. T. 157, № 2. C. 254-257. [Kuleshina O.N., Kozlov L.V., Cheremnykh E.G. Universal method for determining the functional activity of the human complement, laboratory, domestic and farm animals, amphibians and birds]. Byulleten eksperimental`noy biologii i meditsiny = Bulletin of Experimental Biology and Medicine, 2014, Vol. 157, no. 2, pp. 254-257. (In Russ.)]Оганесян Л.П., Мкртчян Г.М., Сукиасян С.Г., Амбарцумян М.К., Аветисян Г.В., Бояджян А.С. Комплемент как патогенный фактор при посттравматическом стрессе // Биологический журнал Армении, 2009. Т. 1, № 61. С. 48-53. [Oganesyan L.P., Mkrtchyan G.M., Sukiasyan S.G., Ambardzumyan M.K., Avetisyan G.V., Boyajyan A.S. Complement as a pathogenic factor in post-traumatic stress]. Biologicheskiy zhurnal Armenii = Biologist. Journal Armenia, 2009, Vol. 1, no. 61, pp. 48-53. (In Russ.)]Оганесян Л.П., Мкртчян Г.М., Сукиасян С.Г., Амбарцумян М.К., Аветисян Г.В., Бояджян А.С. Комплемент как патогенный фактор при посттравматическом стрессе // Биологический журнал Армении, 2009. Т. 1, № 61. С. 48-53. [Oganesyan L.P., Mkrtchyan G.M., Sukiasyan S.G., Ambardzumyan M.K., Avetisyan G.V., Boyajyan A.S. Complement as a pathogenic factor in post-traumatic stress]. Biologicheskiy zhurnal Armenii = Biologist. Journal Armenia, 2009, Vol. 1, no. 61, pp. 48-53. (In Russ.)]Романов С.В., Козлов Л.В., Дьяков В.Л., Баталова Т.Н., Гузова В.А. Определение активности протеиназ системы комплемента иммуноферментными методами // Биомедицинская химия, 2003. Т. 49, № 6. С. 604-612. [Romanov S.C., Kozlov L.V., Dyakov V.L., Batalova T.N., Guzova B.A. Determination of the activity of proteases of the complement system immunoassay methods]. Biomeditsinskaja himiya = Biomedical Chemistry, 2003, Vol. 49, no. 6, pp. 604-612. (In Russ.)]Романов С.В., Козлов Л.В., Дьяков В.Л., Баталова Т.Н., Гузова В.А. Определение активности протеиназ системы комплемента иммуноферментными методами // Биомедицинская химия, 2003. Т. 49, № 6. С. 604-612. [Romanov S.C., Kozlov L.V., Dyakov V.L., Batalova T.N., Guzova B.A. Determination of the activity of proteases of the complement system immunoassay methods]. Biomeditsinskaja himiya = Biomedical Chemistry, 2003, Vol. 49, no. 6, pp. 604-612. (In Russ.)]Bellander B.M., Singhrao S.K., Ohlsson M., Mattsson P., Svensson M. Complement activation in the human brain after traumatic head injury. J. Neurotrauma. 2001, Vol. 18, no. 12, pp. 1295-1311.Bellander B.M., Singhrao S.K., Ohlsson M., Mattsson P., Svensson M. Complement activation in the human brain after traumatic head injury. J. Neurotrauma. 2001, Vol. 18, no. 12, pp. 1295-1311.Ducruet A.F., Zacharia B.E., Sosunov S.A., Gigante P.R., Yeh M.L., Gorski J.W., Otten M.L., Hwang R.Y., DeRosa P.A., Hickman Z.L., Sergot P., Connolly E.S.Jr. Complement Inhibition Promotes Endogenous Neurogenesis and Sustained Anti-Inflammatory Neuroprotection following Reperfused Stroke. PLoS ONE, 2012, Vol. 7, no. 6, p. e38664.Ducruet A.F., Zacharia B.E., Sosunov S.A., Gigante P.R., Yeh M.L., Gorski J.W., Otten M.L., Hwang R.Y., DeRosa P.A., Hickman Z.L., Sergot P., Connolly E.S.Jr. Complement Inhibition Promotes Endogenous Neurogenesis and Sustained Anti-Inflammatory Neuroprotection following Reperfused Stroke. PLoS ONE, 2012, Vol. 7, no. 6, p. e38664.Hillmen P. The role of complement inhibition in PNH. American Society of Hematology, 2008, Vol. 1, pp. 116-123.Hillmen P. The role of complement inhibition in PNH. American Society of Hematology, 2008, Vol. 1, pp. 116-123.Ingram G., Loveless S., Howell O.W., Hakobyan S., Dancey B., Harris C.L., Robertson N.P., Neal J.W., Morgan B.P. Complement activation in multiple sclerosis plaques: an immunohistochemical analysis. Acta Neuropathol. Commun., 2014, Vol. 9, no. 2, p. 53.Ingram G., Loveless S., Howell O.W., Hakobyan S., Dancey B., Harris C.L., Robertson N.P., Neal J.W., Morgan B.P. Complement activation in multiple sclerosis plaques: an immunohistochemical analysis. Acta Neuropathol. Commun., 2014, Vol. 9, no. 2, p. 53.Loeffler D.A., Camp D.M., Bennett D.A. Plaque complement activation and cognitive loss in Alzheimer’s disease. J. Neuroinflammation 2008, Vol. 11, no. 5, p. 9.Loeffler D.A., Camp D.M., Bennett D.A. Plaque complement activation and cognitive loss in Alzheimer’s disease. J. Neuroinflammation 2008, Vol. 11, no. 5, p. 9.Momeni N., Bergquist J., Brudin L., Behnia F., Sivberg B., Joghataei M.T., Persson B.L. A novel blood-based biomarker for detection of autism spectrum disorders. Transl. Psychiatry., 2012, Vol. 13, no. 2, p. e91.Momeni N., Bergquist J., Brudin L., Behnia F., Sivberg B., Joghataei M.T., Persson B.L. A novel blood-based biomarker for detection of autism spectrum disorders. Transl. Psychiatry., 2012, Vol. 13, no. 2, p. e91.Palikhe A., Sinisalo J., Seppänen M., Haario H., Meri S., Valtonen V., Nieminen M.S., Lokki M.L. Serum complement c3/c4 ratio, a novel marker for recurrent cardiovascular events. Am. J. Cardiol., 2007, Vol. 1, no. 99 (7), pp. 890-895.Palikhe A., Sinisalo J., Seppänen M., Haario H., Meri S., Valtonen V., Nieminen M.S., Lokki M.L. Serum complement c3/c4 ratio, a novel marker for recurrent cardiovascular events. Am. J. Cardiol., 2007, Vol. 1, no. 99 (7), pp. 890-895.Roos A., Bouwman L.H., van Gijlswijk-Janssen D.J., Faber-Krol M.C., Stahl G.L., Daha M.R., Human IgA activates the complement system via the mannan-binding lectin pathway. J. Immunol.,2001, Vol. 1, no. 167 (5), pp. 2861-2868.Roos A., Bouwman L.H., van Gijlswijk-Janssen D.J., Faber-Krol M.C., Stahl G.L., Daha M.R., Human IgA activates the complement system via the mannan-binding lectin pathway. J. Immunol.,2001, Vol. 1, no. 167 (5), pp. 2861-2868.Sinclair I.J.B. The Role of Complement in the Immune Reactions of Paramecium aurelia and Tetrahymena pyriformis. Immunology, 1958, Vol. 1, no. 3, pp. 291-299.Sinclair I.J.B. The Role of Complement in the Immune Reactions of Paramecium aurelia and Tetrahymena pyriformis. Immunology, 1958, Vol. 1, no. 3, pp. 291-299.Song C., Dinan T., Leonard B.E. Changes in immunoglobulin, complement and acute phase protein levels in the depressed patients and normal controls. J. Affect. Disord., 1994, Vol. 30, no. 4, pp. 283-288.Song C., Dinan T., Leonard B.E. Changes in immunoglobulin, complement and acute phase protein levels in the depressed patients and normal controls. J. Affect. Disord., 1994, Vol. 30, no. 4, pp. 283-288.Spivak B., Radwan M., Brandon J., Baruch Y., Stawski M., Tyano S., Weizman A. Reduced total complement haemolytic activity in schizophrenic patients. Psychol. Med., 1993, Vol. 23, no. 2, pp. 315-318.Spivak B., Radwan M., Brandon J., Baruch Y., Stawski M., Tyano S., Weizman A. Reduced total complement haemolytic activity in schizophrenic patients. Psychol. Med., 1993, Vol. 23, no. 2, pp. 315-318.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.