mimmunМедицинская иммунологияMedical Immunology (Russia)1563-06252313-741XSPb RAACI10.15789/1563-0625-2015-1-19-26mimmun-803Research ArticleОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИORIGINAL ARTICLESОПЫТ ИЗМЕРЕНИЯ ПАРАМЕТРОВ ИММУННОГО СТАТУСА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ШЕСТИЦВЕТНОГО ЦИТОФЛУОРИМЕТРИЧЕСКОГО АНАЛИЗАAPPLICATION OF SIX-COLOR FLOW CYTOMETRIC ANALYSIS FOR IMMUNE PROFILE MONITORINGКудрявцевИ. В.KudryavtsevI. V.

к.б.н., старший научный сотрудник, отдел иммунологии, ФГБУ «Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины» СЗО РАМН, Санкт-Петербург; доцент школы биомедицины, Дальневосточный федеральный университет, г. Владивосток, Россия

PhD (Biology), Senior Research Associate, Department of Immunology, Institute of Experimental Medicine, North-West Branch of the Russian Academy of Medical Sciences, St. Petersburg; Associate Professor, School of Biomedicine, Far Eastern Federal University, Vladivostok, Russian Federation

igorek1981@yandex.ruСубботовскаяА. И.SubbotovskayaA. I.

к.м.н., младший научный сотрудник, ФГБУ «Новосибирский научно-исследовательский институт патологии кровообращения имени академика Е.Н. Мешалкина» Министерства здравоохранения РФ, г. Новосибирск, Россия

PhD (Medicine), Junior Research Associate, E.N. Meshalkin Research Institute of Circulation Pathology, Russian MInistry of Health Care, Novosibirsk, Russian Federation 

ФГБУ «Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины» СЗО РАМН 197376, Россия, Санкт-Петербург, ул. акад. Павлова, 12. Дальневосточный федеральный университет, г. Владивосток, РоссияРоссияResearch Institute of Experimental Medicine, Russian Academy of Medical Sciences 197376, Russian Federation, St. Petersburg, I. Pavlov str., 12. Far Eastern Federal University, Vladivostok, Russian FederationRussian FederationФГБУ «Новосибирский научно-исследовательский институт патологии кровообращения имени академика Е.Н. Мешалкина» МЗ РФ, г. Новосибирск, РоссияРоссияE.N.Meshalkin Research Institute of Circulation Pathology, Russian Ministry of Health Care, Novosibirsk, Russian FederationRussian Federation2015190320151711926Copyright © Кудрявцев И.В., Субботовская А.И., 20152015Кудрявцев И.В., Субботовская А.И.Kudryavtsev I.V., Subbotovskaya A.I.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.mimmun.ru/mimmun/article/view/803

В статье рассматриваются вопросы использования 6-цветного анализа для исследования параметров иммунного статуса методом проточной цитометрии. Цельная кровь условно здоровых доноров окрашивалась комбинацией моноклональных антител HLA-DR-FITC, CD16+56-PE, CD4-ECD, CD19-ECD, CD8-PC5.5, CD3-PC7, CD45-APC (Beckman Coulter, США) по безотмывочной технологии. Для настройки напряжения ФЭУ проточного цитометра использовали пробирки, окрашенные каждым моноклональным антителом по отдельности, оптимальным считали напряжение при нахождении негативной популяции по центру первой декады логарифмической шкалы. Настройка компенсаций осуществлялась в автоматическом режиме программного обеспечения проточного цитометра Navios (Beckman Coulter, США). Также рассматривается оптимальная «стратегия гейтирования» для получения искомых популяций Т-клеток (CD3+CD19-), Т-хелперов (CD3+CD4+), цитотоксических Т-лимфоцитов (CD3+CD8+), В-клеток (CD3-CD19+), NK-клеток (CD3-CD56+), NКТ-клеток (CD3+CD56+), активированных Т-лимфоцитов (CD3+HLA-DR+).

The article deals with applications of six-color flow analysis for studying the immune state parameters by means of flow cytometry. Whole blood from healthy donors was stained with combination of monoclonal antibodies, i.e., HLA-DR-FITC, CD16+56-PE, CD4-ECD, CD19-ECD, CD8-PC5.5, CD3-PC7, CD45-APC (Beckman Coulter, USA) using a “no-wash” technology. To adjust the photomultiplier (PMT) voltage, we used the tubes with each of the tested monoclonal antibodies, PMT voltage was considered optimal when the negative population was located in the middle of the first decade at the logarithmic scale. The compensatory adjustment was performed in automatic mode, using Navios software (Beckman Coulter, USA). We discuss an optimal gating strategy in order to assess the populations of interest: total T cells (CD3+CD19-), T helper cells (CD3+CD4+), cytotoxic T lymphocytes (CD3+CD8+), B cells (CD3-CD19+), NK cells (CD3-CD16+CD56+), NKT cells (CD3+CD16+CD56+), activated T lymphocytes (CD3+HLA-DR+). 

проточная цитометриямногоцветный анализиммунофенотипирование лимфоцитовflow cytometrymulticolor analysisimmunophenotypingReferencesБайдун Л.А., Зурочка А.В., Тотолян Арег А., Хайдуков С.В. Стандартизованная технология «исследование субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови с применением проточных цитофлюориметров-анализаторов» (проект) // Медицинская иммунология, 2012. Т. 14, No 3. С.255-268.[Ba’dun L.A., Zurochka A.V., Totolian Areg A., Khaidukov S.V. Stadartizovannaya tekhnologiya "issledovanie subpopuliasionnogo soslava limphocytov pirifericheskoy krovi s primenemiem protochnih cytophluorimetrov-analizatorov" (proekt). Meditsinskaya immunologia = Medical Immunology (Russia), 2012, Vol. 14, no.3. pp. 255-268. (In Russ.)]Байдун Л.А., Зурочка А.В., Тотолян Арег А., Хайдуков С.В. Стандартизованная технология «исследование субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови с применением проточных цитофлюориметров-анализаторов» (проект) // Медицинская иммунология, 2012. Т. 14, No 3. С.255-268.[Ba’dun L.A., Zurochka A.V., Totolian Areg A., Khaidukov S.V. Stadartizovannaya tekhnologiya "issledovanie subpopuliasionnogo soslava limphocytov pirifericheskoy krovi s primenemiem protochnih cytophluorimetrov-analizatorov" (proekt). Meditsinskaya immunologia = Medical Immunology (Russia), 2012, Vol. 14, no.3. pp. 255-268. (In Russ.)]Зурочка А.В., Хайдуков С.В., Кудрявцев И.В., Черешнев В.А.. Проточная цитометрия в медицине и биологии. Екатеринбург: РИО УрОРАН, 2013. 552 с. [Zurochka A.V., Khaidukov S.V., Kudryavtsev I.V., Chereshnev V.A. Flow cytometry in medicine and biology]. Ekaterinburg: RIO UrORAN, 2013. 552 p.Зурочка А.В., Хайдуков С.В., Кудрявцев И.В., Черешнев В.А.. Проточная цитометрия в медицине и биологии. Екатеринбург: РИО УрОРАН, 2013. 552 с. [Zurochka A.V., Khaidukov S.V., Kudryavtsev I.V., Chereshnev V.A. Flow cytometry in medicine and biology]. Ekaterinburg: RIO UrORAN, 2013. 552 p.Autissier P., Soulas C., Burdo T.H., Williams K.C. Evaluation of a 12-color flow cytometry panel to study lymphocyte, monocyte, and dendritic cell subsets in humans. Cytometry A, 2010, Vol. 77. pp. 410-419.Autissier P., Soulas C., Burdo T.H., Williams K.C. Evaluation of a 12-color flow cytometry panel to study lymphocyte, monocyte, and dendritic cell subsets in humans. Cytometry A, 2010, Vol. 77. pp. 410-419.Bendall S.C., Nolan G.P., Roederer M., Chattopadhyay P.K. A deep profiler’s guide to cytometry. Trends Immunol., 2012, Vol. 33, pp. 323-332.Bendall S.C., Nolan G.P., Roederer M., Chattopadhyay P.K. A deep profiler’s guide to cytometry. Trends Immunol., 2012, Vol. 33, pp. 323-332.Chattopadhyay P.K., Price D.A., Harper T.F., Betts M.R., Yu J., Gostick E., Perfetto S.P., Goepfert P., Koup R.A., De Rosa S.C., Bruchez M.P., Roederer M. Quantum dot semiconductor nanocrystals for immunophenotyping by polychromatic flow cytometry. Nat. Med., 2006, Vol. 12, pp. 972-977.Chattopadhyay P.K., Price D.A., Harper T.F., Betts M.R., Yu J., Gostick E., Perfetto S.P., Goepfert P., Koup R.A., De Rosa S.C., Bruchez M.P., Roederer M. Quantum dot semiconductor nanocrystals for immunophenotyping by polychromatic flow cytometry. Nat. Med., 2006, Vol. 12, pp. 972-977.Chattopadhyay P.K., Roederer M. Cytometry: today’s technology and tomorrow’s horizons. Methods, 2012, Vol. 57, pp. 251-258.Chattopadhyay P.K., Roederer M. Cytometry: today’s technology and tomorrow’s horizons. Methods, 2012, Vol. 57, pp. 251-258.De Rosa S.C., Herzenberg L.A., Herzenberg L.A., Roederer M. 11-color, 13-parameter flow cytometry: identification of human naive T cells by phenotype, function, and T-cell receptor diversity. Nat. Med., 2001, Vol. 7, pp. 245-248.De Rosa S.C., Herzenberg L.A., Herzenberg L.A., Roederer M. 11-color, 13-parameter flow cytometry: identification of human naive T cells by phenotype, function, and T-cell receptor diversity. Nat. Med., 2001, Vol. 7, pp. 245-248.Horvatinovich J.M., Sparks S.D., Mann K.P. Establishing a pure lymphocyte gate for subset analysis by flow cytometry. Cytometry, 1996, Vol. 26, pp. 172-177.Horvatinovich J.M., Sparks S.D., Mann K.P. Establishing a pure lymphocyte gate for subset analysis by flow cytometry. Cytometry, 1996, Vol. 26, pp. 172-177.Lansdorp P.M., Smith C., Safford M., Terstappen L.W., Thomas T.E. Single laser three color immunofluorescence staining procedures based on energy transfer between phycoerythrin and cyanine 5. Cytometry, 1991, Vol. 12, pp. 723-730.Lansdorp P.M., Smith C., Safford M., Terstappen L.W., Thomas T.E. Single laser three color immunofluorescence staining procedures based on energy transfer between phycoerythrin and cyanine 5. Cytometry, 1991, Vol. 12, pp. 723-730.Maecker H.T., Frey T., Nomura L.E., Trotter J. Selecting fluorochrome conjugates for maximum sensitivity. Cytometry A, 2004, Vol. 62, pp. 169-173.Maecker H.T., Frey T., Nomura L.E., Trotter J. Selecting fluorochrome conjugates for maximum sensitivity. Cytometry A, 2004, Vol. 62, pp. 169-173.Mahnke Y.D., Roederer M. Optimizing a multicolor immunophenotyping assay. Clin. Lab. Med., 2007, Vol. 27, pp. 469-485.Mahnke Y.D., Roederer M. Optimizing a multicolor immunophenotyping assay. Clin. Lab. Med., 2007, Vol. 27, pp. 469-485.Mandy F.F., Nicholson J.K., McDougal J.S.; CDC. Guidelines for performing single-platform absolute CD4+ T-cell determinations with CD45 gating for persons infected with human immunodeficiency virus. Centers for Disease Control and Prevention. MMWR Recomm. Rep., 2003, Vol. 52, RR-2, pp. 1-13.Mandy F.F., Nicholson J.K., McDougal J.S.; CDC. Guidelines for performing single-platform absolute CD4+ T-cell determinations with CD45 gating for persons infected with human immunodeficiency virus. Centers for Disease Control and Prevention. MMWR Recomm. Rep., 2003, Vol. 52, RR-2, pp. 1-13.Roederer M., De Rosa S., Gerstein R., Anderson M., Bigos M., Stovel R., Nozaki T., Parks D., Herzenberg L., Herzenberg L. 8 color, 10-parameter flow cytometry to elucidate complex leukocyte heterogeneity. Cytometry, 1997, Vol. 29, pp. 328-339.Roederer M., De Rosa S., Gerstein R., Anderson M., Bigos M., Stovel R., Nozaki T., Parks D., Herzenberg L., Herzenberg L. 8 color, 10-parameter flow cytometry to elucidate complex leukocyte heterogeneity. Cytometry, 1997, Vol. 29, pp. 328-339.Roederer M., Kantor A.B., Parks D.R., Herzenberg L.A. Cy7PE and Cy7APC: bright new probes for immunofluorescence. Cytometry, 1996, Vol. 24, pp. 191-197.Roederer M., Kantor A.B., Parks D.R., Herzenberg L.A. Cy7PE and Cy7APC: bright new probes for immunofluorescence. Cytometry, 1996, Vol. 24, pp. 191-197.Schenker E.L., Hultin L.E., Bauer K.D., Ferbas J., Margolick J.B., Giorgi J.V. Evaluation of a dual-color flow cytometry immunophenotyping panel in a multicenter quality assurance program. Cytometry, 1993, Vol. 14, pp. 307-317.Schenker E.L., Hultin L.E., Bauer K.D., Ferbas J., Margolick J.B., Giorgi J.V. Evaluation of a dual-color flow cytometry immunophenotyping panel in a multicenter quality assurance program. Cytometry, 1993, Vol. 14, pp. 307-317.Soghoian D.Z., Jessen H., Flanders M., Sierra-Davidson K., Cutler S., Pertel T., Ranasinghe S., Lindqvist M., Davis I., Lane K., Rychert J., Rosenberg E.S., Piechocka-Trocha A., Brass A.L., Brenchley J.M., Walker B.D., Streeck H. HIV-specific cytolytic CD4 T cell responses during acute HIV infection predict disease outcome. Sci. Transl. Med., 2012, Vol. 4, pp. 123-125.Soghoian D.Z., Jessen H., Flanders M., Sierra-Davidson K., Cutler S., Pertel T., Ranasinghe S., Lindqvist M., Davis I., Lane K., Rychert J., Rosenberg E.S., Piechocka-Trocha A., Brass A.L., Brenchley J.M., Walker B.D., Streeck H. HIV-specific cytolytic CD4 T cell responses during acute HIV infection predict disease outcome. Sci. Transl. Med., 2012, Vol. 4, pp. 123-125.Steinkamp J.A., Orlicky D.A., Crissman H.A. Dual-laser flow cytometry of single mammalian cells. J. Histochem. Cytochem., 1979, Vol. 27, pp. 273-276.Steinkamp J.A., Orlicky D.A., Crissman H.A. Dual-laser flow cytometry of single mammalian cells. J. Histochem. Cytochem., 1979, Vol. 27, pp. 273-276.Telford W.G. Lasers in flow cytometry. Methods Cell. Biol., 2011, Vol. 102, pp. 375-409.Telford W.G. Lasers in flow cytometry. Methods Cell. Biol., 2011, Vol. 102, pp. 375-409.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.