mimmunМедицинская иммунологияMedical Immunology (Russia)1563-06252313-741XSPb RAACI10.15789/1563-0625-2014-6-577-586mimmun-771Research ArticleОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИORIGINAL ARTICLESИММУНОМОДУЛИРУЮЩИЙ ЭФФЕКТ ЦИРКУЛИРУЮЩИХ КОСТНОМОЗГОВЫХ ПРЕДШЕСТВЕННИКОВ КАК ВОЗМОЖНЫЙ МЕХАНИЗМ НЕЙРОПРОТЕКЦИИ ПРИ ЧЕРЕПНО-МОЗГОВОЙ ТРАВМЕIMMUNOMODULATORY EFFECT OF CIRCULATING BONE MARROW PROGENITORS AS A POSSIBLE MECHANISM OF NEUROPROTECTION IN TRAUMATIC BRAIN INJURYЧерныхВ. А.ChernykhV. A.

аспирант 3-го года обучения, ФГБУ «Новосибирский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии» МЗ РФ, г. Новосибирск, Россия

ПронкинаН. В.PronkinaN. V.

к.б.н., заведующая лабораторией, ФГБУ «НИИ клинической иммунологии» СО РАМН, г. Новосибирск, Россия

ШевелаЕ. Я.ShevelaE. Ya.

д.м.н., старший научный сотрудник, ФГБУ «НИИ клинической иммунологии» СО РАМН, г. Новосибирск, Россия

СтупакВ. В.StupakV. V.

д.м.н., профессор, заведующий отделением нейрохирургии, ФГБУ «Новосибирский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии» МЗ РФ, г. Новосибирск, Россия

РабиновичС. С.RabinovichS. S.

д.м.н., профессор, главный научный сотрудник, ФГБУ «Новосибирский научно- исследовательский институт травматологии и ортопедии» МЗ РФ, г. Новосибирск, Россия

ЧерныхЕ. Р.ChernykhE. R.

д.м.н., профессор, член-корр. РАН, заместитель директора по научной работе, заведующая лабораторией, ФГБУ «НИИ клинической иммунологии» СО РАМН, г. Новосибирск, Россия

ОстанинА. А.OstaninA. A.

д.м.н., профессор, главный научный сотрудник, ФГБУ «НИИ клинической иммунологии» СО РАМН, г. Новосибирск, Россия

ФГБУ «Новосибирский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии» Министерства здравоохранения РФ, г. Новосибирск, Россия 630099, Россия, г. Новосибирск, ул. Ядринцевская, 14. Тел.: 8 (383) 228-21-01РоссияNovosibirsk Research Institute of Traumatology and Orthopedics MH RF, Novosibirsk, Russian Federation 630099, Russian Federation, Novosibirsk, Jadrincevskajа str., 14 Phone: 7 (383) 228-21-01Russian FederationФГБУ «НИИ клинической иммунологии» СО РАМН, г. Новосибирск, РоссияРоссияInstitute of Clinical Immunology SB RAMS, Novosibirsk, Russian FederationRussian FederationФГБУ «Новосибирский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии» Министерства здравоохранения РФ, г. Новосибирск, РоссияРоссияNovosibirsk Research Institute of Traumatology and Orthopedics MH RF, Novosibirsk, Russian FederationRussian Federation201427012015166577586Copyright © Черных В.А., Пронкина Н.В., Шевела Е.Я., Ступак В.В., Рабинович С.С., Черных Е.Р., Останин А.А., 20152015Черных В.А., Пронкина Н.В., Шевела Е.Я., Ступак В.В., Рабинович С.С., Черных Е.Р., Останин А.А.Chernykh V.A., Pronkina N.V., Shevela E.Y., Stupak V.V., Rabinovich S.S., Chernykh E.R., Ostanin A.A.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.mimmun.ru/mimmun/article/view/771

Ранее нами выявлено повышенное содержание циркулирующих костномозговых предшественников у пациентов в остром периоде черепно-мозговой травмы (ЧМТ) и продемонстрировано, что благоприятный исход сопряжен с ранней мобилизацией CD34+CD45+ гемопоэтических предшественников (ГП). Настоящая работа посвящена изучению особенностей системной воспалительной реакции и параметров иммунитета в группах пациентов с наличием и отсутствием ранней мобилизации ГП. Установлено, что пациенты с ЧМТ характеризуются повышенным содержанием в сыворотке крови С-реактивного белка (СРБ), IL-1β, IL-6, IL-8, MCP-1, G-CSF и IL-1ra, что свидетельствует о наличии системной воспалительной реакции. При этом у пациентов с отсутствием ранней мобилизацией ГП выявляется достоверно более высокое содержание в сыворотке крови СРБ, MCP-1, MIP-1β и G-CSF и меньший уровень VEGF. Кроме того, пациенты с отсутствием ранней мобилизации ГП отличаются достоверно более низкими показателями абсолютного содержания лимфоцитов, CD3+Т-клеток, CD4+Т-клеток, CD16+NК-клеток и пролиферативного ответа мононуклеарных клеток на КонА, а также 4-кратно большей частотой инфекционных осложнений по сравнению с оппозитной группой. Предполагается, что сопряженность ранней мобилизацией CD34+CD45+ клеток с благоприятным исходом при ЧМТ может быть отчасти обусловлена противовоспалительным и иммуномодулирующим эффектами циркулирующих костномозговых предшественников.

We have previously shown that acute traumatic brain injury (TBI) is accompanied by increased level of circulating bone marrow progenitors, and favorable outcome is associated with early mobilization of CD34+CD45+ hematopoietic progenitor cells (HP). The present study was aimed at investigating whether patients with early HP mobilization differed from those with mobilization failure by systemic inflammatory reaction and immune parameters. The TBI patients were characterized by increased levels of serum C-reactive protein (CRP), IL-1в, IL-6, IL-8, MCP-1, G-CSF and IL-1ra indicative for presence of systemic inflammatory response. Importantly, patients with lacking mobilization of early HPs were shown to have significantly higher serum levels of CRP, MCP-1, MIP-1в, and G-CSF and a lower level of VEGF. In addition, patients with lack of early HP mobilization differed by significantly lower absolute number of lymphocytes, CD3+ T cells, CD4+ T cells, CD16+ NK cells and proliferative response of mononuclear cells to stimulation with ConA as well as by 4-fold higher rate of infectious complications compared with the opposite group. These data suggest that correlation of early mobilization of CD34+CD45+ cells with a favorable outcome in TBI patients may be partially mediated by anti-inflammatory and immunomodulatory effects of circulating bone marrow progenitors.

циркулирующие костномозговые предшественникиCD34+CD45+ клеткимобилизация клетокиммуномодуляциячерепно-мозговая травмаcirculating bone marrow progenitorsCD34+CD45+ cellscell mobilizationimmunomodulationtraumatic brain injuryReferencesЧерных В.А., Пронкина Н.В., Шевела Е.Я., Ступак В.В., Фонин В.В., Парлюк О.В., Рабинович С.С., Черных Е.Р., Останин А.А. Циркулирующие костно-мозговые предшественники у пациентов с различными исходами черепно-мозговой травмы // Политравма, 2012. № 2. С. 10-15. [Chernykh V.A., Pronkina N.V., Shevela E.Y., Stupak V.V., Fonin V.V., Parluk O.V., Rabinovich S.S., Chernykh E.R., Ostanin A.A. Circulating bone marrow precursors in patients with different outcomes of traumatic brain injury. Politravma = Polytrauma, 2012, no. 2, pp. 10-15. (In Russ.)]Черных В.А., Пронкина Н.В., Шевела Е.Я., Ступак В.В., Фонин В.В., Парлюк О.В., Рабинович С.С., Черных Е.Р., Останин А.А. Циркулирующие костно-мозговые предшественники у пациентов с различными исходами черепно-мозговой травмы // Политравма, 2012. № 2. С. 10-15. [Chernykh V.A., Pronkina N.V., Shevela E.Y., Stupak V.V., Fonin V.V., Parluk O.V., Rabinovich S.S., Chernykh E.R., Ostanin A.A. Circulating bone marrow precursors in patients with different outcomes of traumatic brain injury. Politravma = Polytrauma, 2012, no. 2, pp. 10-15. (In Russ.)]Черных В.А., Ступак В.В., Фонин В.В., Шишлов П.Е., Пронкина Н.В., Шевела Е.Я., Леплина О.Ю., Черных Е.Р., Останин А.А. Мобилизация костномозговых CD34+CD45+ гемопоэтических предшественников у больных с черепно-мозговой травмой // Российский нейрохирургический журнал им. проф. А.Л. Поленова, 2012. Т. IV, № 1. С. 54-61. [Chernykh V.A., Stupak V.V., Fonin V.V., Shishlov P.E., Pronkina N.V., Shevela E.Ya., Leplina O.Yu., Chernykh E.R., Ostanin A.A. Mobilization of bone-marrow-derived CD34+CD45+hematopoietic progenitors in patients with traumatic brain injury. Rossiyskiy neyrokhirurgicheskiy zhurnal im. prof. A.L. Polenova. = Russian Neurosurgical Journal, 2012, Vol. 4, no. 1, pp. 54-61. (In Russ.)]Черных В.А., Ступак В.В., Фонин В.В., Шишлов П.Е., Пронкина Н.В., Шевела Е.Я., Леплина О.Ю., Черных Е.Р., Останин А.А. Мобилизация костномозговых CD34+CD45+ гемопоэтических предшественников у больных с черепно-мозговой травмой // Российский нейрохирургический журнал им. проф. А.Л. Поленова, 2012. Т. IV, № 1. С. 54-61. [Chernykh V.A., Stupak V.V., Fonin V.V., Shishlov P.E., Pronkina N.V., Shevela E.Ya., Leplina O.Yu., Chernykh E.R., Ostanin A.A. Mobilization of bone-marrow-derived CD34+CD45+hematopoietic progenitors in patients with traumatic brain injury. Rossiyskiy neyrokhirurgicheskiy zhurnal im. prof. A.L. Polenova. = Russian Neurosurgical Journal, 2012, Vol. 4, no. 1, pp. 54-61. (In Russ.)]Clerici M., Cassinotti A., Onida F., Trabattoni D., Annaloro C., Volpe A.D., Rainone V., Lissoni F., Duca P., Sampietro G., Fociani P., Vago G., Foschi D., Ardizzone S., Deliliers G.L., Porro G.B. Immunomodulatory effects of unselected haematopoietic stem cells autotransplantation in refractory Crohns disease. Dig. Liver Dis., 2011, Vol. 43, no. 12, pp. 946-952.Clerici M., Cassinotti A., Onida F., Trabattoni D., Annaloro C., Volpe A.D., Rainone V., Lissoni F., Duca P., Sampietro G., Fociani P., Vago G., Foschi D., Ardizzone S., Deliliers G.L., Porro G.B. Immunomodulatory effects of unselected haematopoietic stem cells autotransplantation in refractory Crohns disease. Dig. Liver Dis., 2011, Vol. 43, no. 12, pp. 946-952.Das M., Mohapatra S., Mohapatra S.S. New perspectives on central and peripheral immune responses to acute traumatic brain injury. J. Neuroinflammation., 2012, Vol. 9, p. 236. doi:10.1186/1742-2094-9-236Das M., Mohapatra S., Mohapatra S.S. New perspectives on central and peripheral immune responses to acute traumatic brain injury. J. Neuroinflammation., 2012, Vol. 9, p. 236. doi:10.1186/1742-2094-9-236Lee S.T., Chu K., Jung K.H., Kim S.J., Kim D.H., Kang K.M., Hong N.H., Kim J.H., Ban J.J., Park H.K. Anti-inflammatory mechanism of intravascular neural stem cell transplantation in haemorrhagic stroke. Brain., 2008, Vol. 131, pp. 616-629.Lee S.T., Chu K., Jung K.H., Kim S.J., Kim D.H., Kang K.M., Hong N.H., Kim J.H., Ban J.J., Park H.K. Anti-inflammatory mechanism of intravascular neural stem cell transplantation in haemorrhagic stroke. Brain., 2008, Vol. 131, pp. 616-629.Meisel C., Schwab J.M., Prass K. Meisel A., Dirnagl U. Central nervous system injury-induced immune deficiency syndrome. Nat. Rev. Neurosci., 2005, Vol. 6, no. 10, pp. 775-786.Meisel C., Schwab J.M., Prass K. Meisel A., Dirnagl U. Central nervous system injury-induced immune deficiency syndrome. Nat. Rev. Neurosci., 2005, Vol. 6, no. 10, pp. 775-786.Miller F.D., Kaplan D.R. Mobilizing endogenous stem cells for repair and regeneration: are we there yet? Cell Stem Cell., 2012, Vol. 10, no. 6, pp. 650-652.Miller F.D., Kaplan D.R. Mobilizing endogenous stem cells for repair and regeneration: are we there yet? Cell Stem Cell., 2012, Vol. 10, no. 6, pp. 650-652.Nervi B., Link D.C., Di Persio J.F. Cytokines and hematopoietic stem cell mobilization. J. Cell Biochem., 2006, Vol. 99, no. 3, pp. 690-705.Nervi B., Link D.C., Di Persio J.F. Cytokines and hematopoietic stem cell mobilization. J. Cell Biochem., 2006, Vol. 99, no. 3, pp. 690-705.Nguyen H.X., O’Barr T.J., Anderson A.J. Polymorphonuclear leukocytes promote neurotoxicity through release of matrix metalloproteinases, reactive oxygen species, and TNF-alpha. J. Neurochem., 2007, Vol. 102, no. 3, pp. 900-912.Nguyen H.X., O’Barr T.J., Anderson A.J. Polymorphonuclear leukocytes promote neurotoxicity through release of matrix metalloproteinases, reactive oxygen species, and TNF-alpha. J. Neurochem., 2007, Vol. 102, no. 3, pp. 900-912.Ohm J.E., Carbone D.P. VEGF as a mediator of tumor-associated immunodeficiency. Immunol. Res., 2001, Vol. 23, no. 2-3, pp. 263-272.Ohm J.E., Carbone D.P. VEGF as a mediator of tumor-associated immunodeficiency. Immunol. Res., 2001, Vol. 23, no. 2-3, pp. 263-272.Pancer G., Engelman E., Hoque F., Alam M., Rucinski J., Bernstein L.H. C-reactive protein for the enhanced evaluation of the systemic inflammatory response syndrome (SIRS). The Open Clinical Chemistry Journal, 2011, Vol. 4, pp. 1-9.Pancer G., Engelman E., Hoque F., Alam M., Rucinski J., Bernstein L.H. C-reactive protein for the enhanced evaluation of the systemic inflammatory response syndrome (SIRS). The Open Clinical Chemistry Journal, 2011, Vol. 4, pp. 1-9.Rathmell J.C., Farkash E.A., Gao W., Thompson C.B. IL-7 enhances the survival and maintains the size of naive T cells. J. Immunol., 2001, Vol. 167, no. 12, pp. 6869-6876.Rathmell J.C., Farkash E.A., Gao W., Thompson C.B. IL-7 enhances the survival and maintains the size of naive T cells. J. Immunol., 2001, Vol. 167, no. 12, pp. 6869-6876.Roberts A.W. G-CSF: a key regulator of neutrophil production, but that’s not all! Growth Factors, 2005, Vol. 23, no. 1, pp. 33-41.Roberts A.W. G-CSF: a key regulator of neutrophil production, but that’s not all! Growth Factors, 2005, Vol. 23, no. 1, pp. 33-41.Schwarting S., Litwak S., Hao W., Bahr M., Weise J., Neumann H. Hematopoietic stem cells reduce postischemic inflammation and ameliorate ischemic brain injury. Stroke., 2008, Vol. 39, no. 10, pp. 2867-2875.Schwarting S., Litwak S., Hao W., Bahr M., Weise J., Neumann H. Hematopoietic stem cells reduce postischemic inflammation and ameliorate ischemic brain injury. Stroke., 2008, Vol. 39, no. 10, pp. 2867-2875.Scott B.N., Roberts D.J., Robertson H.L., Kramer A.H., Laupland K.B., Ousman S.S., Kubes P., Zygun D.A. Incidence, prevalence, and occurrence rate of infection among adults hospitalized after traumatic brain injury: study protocol for a systematic review and meta-analysis. Syst. Rev., 2013, Vol. 2, no. 1, p. 68. doi: 10.1186/2046-4053-2-68Scott B.N., Roberts D.J., Robertson H.L., Kramer A.H., Laupland K.B., Ousman S.S., Kubes P., Zygun D.A. Incidence, prevalence, and occurrence rate of infection among adults hospitalized after traumatic brain injury: study protocol for a systematic review and meta-analysis. Syst. Rev., 2013, Vol. 2, no. 1, p. 68. doi: 10.1186/2046-4053-2-68Shah S., Ulm J., Sifri Z.C., Mohr A.M,. Livingston D.H. Mobilization of bone marrow cells to the site of injury is necessary for wound healing. J. Trauma., 2009, Vol. 67, no. 2, pp. 315-321.Shah S., Ulm J., Sifri Z.C., Mohr A.M,. Livingston D.H. Mobilization of bone marrow cells to the site of injury is necessary for wound healing. J. Trauma., 2009, Vol. 67, no. 2, pp. 315-321.Skirecki T., Zieli ska-Borkowska U., Z otorowicz M., Kawiak J., Hoser G. Mobilization of hematopoietic and nonhematopoietic stem cell subpopulations in sepsis: a preliminary report. Crit. Care., 2012, Vol. 16, suppl. 1, p. 8.Skirecki T., Zieli ska-Borkowska U., Z otorowicz M., Kawiak J., Hoser G. Mobilization of hematopoietic and nonhematopoietic stem cell subpopulations in sepsis: a preliminary report. Crit. Care., 2012, Vol. 16, suppl. 1, p. 8.Smrcka M., Mrlian A., Karlsson-Valik J., Klabusay M. The effect of head injury upon the immune system. Bratisl. Lek. Listy., 2007, Vol. 108, no. 3, pp. 144-148.Smrcka M., Mrlian A., Karlsson-Valik J., Klabusay M. The effect of head injury upon the immune system. Bratisl. Lek. Listy., 2007, Vol. 108, no. 3, pp. 144-148.Sobrino T., Hurtado O., Moro M.A., Rodr guez-Yanez M., Castellanos M., Brea D., Moldes O., Blanco M., Arenillas J.F., Leira R., Davalos A., Lizasoain I., Castillo J. The increase of circulating endothelial progenitor cells after acute ischemic stroke is associated with good outcome. Stroke., 2007, Vol. 38, no 10, pp. 2759-2764.Sobrino T., Hurtado O., Moro M.A., Rodr guez-Yanez M., Castellanos M., Brea D., Moldes O., Blanco M., Arenillas J.F., Leira R., Davalos A., Lizasoain I., Castillo J. The increase of circulating endothelial progenitor cells after acute ischemic stroke is associated with good outcome. Stroke., 2007, Vol. 38, no 10, pp. 2759-2764.Tate C.C., Case C.C. Mesenchymal stromal cells to treat brain injury. Advanced topics in neurological disorders. Chapter in «Neurological Disorders». InTech, 2012, pp. 45-78.Tate C.C., Case C.C. Mesenchymal stromal cells to treat brain injury. Advanced topics in neurological disorders. Chapter in «Neurological Disorders». InTech, 2012, pp. 45-78.Wada J., Suzuki H., Fuchino R., Yamasaki A., Nagai S., Yanai K., Koga K., Nakamura M., Tanaka M., Morisaki T., Katano M. The contribution of vascular endothelial growth factor to the induction of regulatory T-cells in malignant effusions. Anticancer. Res., 2009, Vol. 29, no. 3, pp. 881-888.Wada J., Suzuki H., Fuchino R., Yamasaki A., Nagai S., Yanai K., Koga K., Nakamura M., Tanaka M., Morisaki T., Katano M. The contribution of vascular endothelial growth factor to the induction of regulatory T-cells in malignant effusions. Anticancer. Res., 2009, Vol. 29, no. 3, pp. 881-888.Walker P.A., Letourneau P.A., Bedi S., Shah S.K., Jimenes F., Cox C.S. Progenitor cells as remote “bioreactors”: Neuroprotection via modulation of the systemic inflammatory response. World J. Stem. Cells., 2011, Vol. 3, no. 2, pp. 9-18.Walker P.A., Letourneau P.A., Bedi S., Shah S.K., Jimenes F., Cox C.S. Progenitor cells as remote “bioreactors”: Neuroprotection via modulation of the systemic inflammatory response. World J. Stem. Cells., 2011, Vol. 3, no. 2, pp. 9-18.Ward N.S., Casserly B., Ayala A. The compensatory anti-inflammatory response syndrome (CARS) in critically ill patients. Clin. Chest Med., 2008, Vol. 29, no. 4, pp. 617-625.Ward N.S., Casserly B., Ayala A. The compensatory anti-inflammatory response syndrome (CARS) in critically ill patients. Clin. Chest Med., 2008, Vol. 29, no. 4, pp. 617-625.Wojakowski W., Tendera M., Zebzda A., Michalowska A., Majka M., Kucia M., Maslankiewicz K., Wyderka R., Kr l M., Ochala A., Kozakiewicz K., Ratajczak M.Z. Mobilization of CD34(+), CD117(+),Wojakowski W., Tendera M., Zebzda A., Michalowska A., Majka M., Kucia M., Maslankiewicz K., Wyderka R., Kr l M., Ochala A., Kozakiewicz K., Ratajczak M.Z. Mobilization of CD34(+), CD117(+),CXCR4(+), c-met(+) stem cells is correlated with left ventricular ejection fraction and plasma NT-proBNP levels in patients with acute myocardial infarction. Eur. Heart. J., 2006, Vol. 27, no. 3, pp. 283-289.CXCR4(+), c-met(+) stem cells is correlated with left ventricular ejection fraction and plasma NT-proBNP levels in patients with acute myocardial infarction. Eur. Heart. J., 2006, Vol. 27, no. 3, pp. 283-289.Woodcock T., Morganti-Kossmann M.C. The role of markers of inflammation in traumatic brain injury. Front. Neurol., 2013, Vol. 4, p. 18. doi:10.3389/fneur.2013.00018Woodcock T., Morganti-Kossmann M.C. The role of markers of inflammation in traumatic brain injury. Front. Neurol., 2013, Vol. 4, p. 18. doi:10.3389/fneur.2013.00018Xiong Y., Mahmood A., Chopp M. Angiogenesis, neurogenesis and brain recovery of function following injury. Curr. Opin. Investig. Drugs., 2010, Vol. 11, no. 3, pp. 298-308.Xiong Y., Mahmood A., Chopp M. Angiogenesis, neurogenesis and brain recovery of function following injury. Curr. Opin. Investig. Drugs., 2010, Vol. 11, no. 3, pp. 298-308.Yamada M., Kubo H., Ishizawa K., Kobayashi S., Shinkawa M., Sasaki H. Increased circulating endothelial progenitor cells in patients with bacterial pneumonia: evidence that bone marrow derived cells contribute to lung repair. Thorax., 2005, Vol. 60, no. 5, pp. 410-413.Yamada M., Kubo H., Ishizawa K., Kobayashi S., Shinkawa M., Sasaki H. Increased circulating endothelial progenitor cells in patients with bacterial pneumonia: evidence that bone marrow derived cells contribute to lung repair. Thorax., 2005, Vol. 60, no. 5, pp. 410-413.Zhang Z.G., Chopp M. Neurorestorative therapies for stroke: underlying mechanisms and translation to the clinic. Lancet Neurol., 2009, Vol. 8, no. 5, pp. 491-500.Zhang Z.G., Chopp M. Neurorestorative therapies for stroke: underlying mechanisms and translation to the clinic. Lancet Neurol., 2009, Vol. 8, no. 5, pp. 491-500.Zhao Y., Wang L., Jin Y., Shi S. Fas ligand regulates the immunomodulatory properties of dental pulp stem cells. J. Dent Res., 2012, Vol. 91, no. 10, pp. 948-954.Zhao Y., Wang L., Jin Y., Shi S. Fas ligand regulates the immunomodulatory properties of dental pulp stem cells. J. Dent Res., 2012, Vol. 91, no. 10, pp. 948-954.Ziebell J.M., Morganti-Kossmann M.C. Involvement of pro- and anti-inflammatory cytokines and chemokines in the pathophysiology of traumatic brain injury. Neurotherapeutics., 2010, Vol. 7, no. 1, pp. 22-30.Ziebell J.M., Morganti-Kossmann M.C. Involvement of pro- and anti-inflammatory cytokines and chemokines in the pathophysiology of traumatic brain injury. Neurotherapeutics., 2010, Vol. 7, no. 1, pp. 22-30.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.