к.м.н., доцент, доцент кафедры клинической лабораторной диагностики дополнительного профессионального образования, заведующий центральной научно-исследовательской лабораторией
PhD (Medicine), Associate Professor, Associate Professor of the Department of Clinical Laboratory Diagnostics of Continuing Professional Education, Head of the Central Research Laboratory
к.м.н., доцент, старший научный сотрудник центральной научно-исследовательской лабораторией, доцент кафедры патофизиологии
PhD (Medicine), Associate Professor, Senior Researcher of the Central Research Laboratory; Associate Professor of the Department of Pathophysiology
д.м.н., доцент, заведующая кафедрой микробиологии, вирусологии и иммунологии, директор Научно-исследовательского института иммунологии
PhD, MD (Medicine), Associate Professor, Head of the Department of Microbiology, Virology and Immunology, Director of the Research Institute of Immunology
д.м.н., доцент, заведующий кафедрой клинической лабораторной диагностики дополнительного профессионального образования
PhD, MD (Medicine), Associate Professor, Head, Department of Clinical Laboratory Diagnostics of Continuing Professional Education
д.м.н., профессор, проректор по научно-исследовательской работе, заведующая кафедрой патофизиологии
PhD, MD (Medicine), Professor, Vice-Rector for Research, Head, Department of Pathophysiology
ассистент кафедры клинической лабораторной диагностики дополнительного профессионального образования, младший научный сотрудник центральной научно-исследовательской лаборатории
Assistant Professor of the Department of Clinical Laboratory Diagnostics of Continuing Professional Education, Junior Researcher of the Central Research Laboratory
Феномен образования нейтрофильных внеклеточных ловушек (НВЛ), или нетоз, играет ключевую роль в патогенезе инфекционных и воспалительных заболеваний. Однако отсутствие стандартизированных методов оценки НВЛ затрудняет корректную интерпретацию результатов. Цель исследования – разработать применимую на практике методику исследования способности нейтрофилов к формированию НВЛ, позволяющую корректно идентифицировать сопряженные с нетозом феномены. Нейтрофилы выделяли из периферической крови 15 здоровых доноров методом градиентного центрифугирования (фиколл-верографин, градиент плотности 1,077-1,105 г/мл). Для стимуляции нетоза использовали смесь бактерий (Lactobacillus reuteri, L. acidophilus, L. rhamnosus, Bifidobacterium longum). Для визуализации НВЛ и других люминесцентно-позитивных объектов использовали интеркалирующий краситель пропидия йодид и антитела моноклональные мышиные к человеческим CD15/FITC. Люминесцентную микроскопию проводили при длине волны возбуждения 450-480 нм, эмиссии – от 515 нм. В препарате регистрировали интактные нейтрофилы (объекты ярко-зеленого цвета, без прокрашенного ядра), активированные нейтрофилы (ярко-зеленые с красно-оранжевым, окрашенным пропидия йодидом ядром), клетки раннего нетоза (ярко-зеленые клетки с выходом ядерного материала в одной или более локации за пределы клеточной мембраны), НВЛ: облаковидные (в виде «облака», окружающего нейтрофил или его фрагменты со всех сторон и более чем 1,5 раза больше его размера) и нитевидные (в виде нитей в 2 и более раза больше размера нейтрофила). Определяли долю каждого из типов наблюдаемых объектов относительно всех люминесцентно-позитивных объектов. В ходе оптимизации методики определены ключевые параметры: температура инкубации лейкоцитов со стимулятором (37 °C), его концентрация (2,5 × 109 бактерий/мл), время стимуляции (30 мин). Оценка воспроизводимости метода показала приемлемый межсерийный коэффициент вариации: 13,8% для нитевидных и 15,2% для облаковидных НВЛ. Метод исследования был применен в различных группах пациентов, имеющих определенную инфекционную (туберкулез легких) и неинфекционную патологию (язвенный колит, аневризмальные костные кисты). Результаты оценки способности нейтрофилов к образованию НВЛ у представителей обследуемых когорт позволяют сделать вывод о достаточном уровне чувствительности и манифестности регистрируемых с помощью данной методики показателей.
The phenomenon of neutrophil extracellular trap (NETs) formation, or netosis, plays a key role in pathogenesis of infectious and inflammatory diseases. However, the lack of standardized methods for assessing NETs makes it difficult to correctly interpret the results. The aim of our study was to develop a feasible methodology to investigate the ability of neutrophils to form NETs, which would allow precise identification of netosis-associated phenomena. Neutrophils were isolated from peripheral blood of 15 healthy donors by gradient centrifugation (Ficoll-Verographin, density gradient 1.077-1.105 g/mL). A mixture of bacteria (Lactobacillus reuteri, L. acidophilus, L. rhamnosus, Bifidobacterium longum) was used to stimulate netosis. Propidium iodide (PI), a DNA-intercalating dye, and murine monoclonal antibodies to human CD15/FITC were used to visualize NETs and other fluorescent objects. Luminescence microscopy was performed at excitation wavelengths of 450-480 nm and emission wavelengths of 515 nm. We have registered the following morphological variants: (1) intact neutrophils (bright green, without nuclear staining); (2) activated neutrophils (bright green with a red-orange, PI-stained nucleus); (3) early netosis cells (bright green cells with nuclear material released to one or more sites at cell membrane); (4) NETs: (a) cloud-shaped objects surrounding the neutrophil or its fragments from all sides, being and more than 1.5 times its size, and (b) filamentous forms seen as filament structures exceeding the neutrophil size>2-fold or more. The proportion of each type of observed objects relative to all fluorescent-positive objects was determined. Upon optimization of this method, the key parameters were determined: temperature of cell incubation with the stimulant (37 °C); its concentration (2.5x109 bacteria/ mL), stimulation time (30 min). Testing the reproducibility of this technique showed an acceptable inter-series coefficient of variation (CV): 13.8% for filamentous and 15.2% for cloud-shaped NETs. The proposed method was applied in different groups of patients with certain infectious (pulmonary tuberculosis) and non-infectious pathology (ulcerative colitis, aneurysmal bone cysts). Testing the NET-producing ability of neutrophils in the subjects from these cohorts allows us to conclude that the levels of sensitivity and manifestations for these indexes registered with this technique are quite satisfactory.
The authors declare that there are no conflicts of interest present.