mimmunМедицинская иммунологияMedical Immunology (Russia)1563-06252313-741XSPb RAACI10.15789/1563-0625-TIR-16841mimmun-3099Research ArticleКРАТКИЕ СООБЩЕНИЯSHORT COMMUNICATIONSИммунный ответ, формируемый введением трансгенным мышам ДНК-вектора, содержащего фрагмент кДНК гена рецептора тиреотропного гормона человекаThe immune response formed by the introduction of a DNA vector containing a cDNA fragment of the human thyroid-stimulating hormone receptor gene into transgenic miceЗубковА. В.ZubkovA. V.

Зубков Александр Владимирович – к.м.н., заведующий лабораторией иммунологической диагностики эндокринных заболеваний.

105064, Москва, Малый Казенный пер., 5а

Тел.: 8 (903) 618-02-78

Alexander V. Zubkov - PhD (Medicine), Head, Laboratory of Immunological Diagnostics of Endocrine Diseases, I. Mechnikov Research Institute of Vaccine and Sera.

5a Maly Kazenny Lane Moscow 105064

Phone: +7 (903) 618-02-78

alex_zubkov@list.ruБутоваЛ. Г.ButovaL. G.

К.б.н., ведущий научный сотрудник лаборатории иммунологической диагностики эндокринных заболеваний.

Москва

PhD (Biology), Leading Research Associate, Laboratory of Immunological Diagnostics of Endocrine Diseases, I. Mechnikov Research Institute of Vaccine and Sera.

Moscow

КузьминаН. С.KuzminaN. S.

К.б.н., ведущий научный сотрудник лаборатории иммунологической диагностики эндокринных заболеваний.

Москва

PhD (Biology), Leading Research Associate, Laboratory of Immunological Diagnostics of Endocrine Diseases, I. Mechnikov Research Institute of Vaccine and Sera.

Moscow

ЯковлеваИ. В.YakovlevaI. V.

К.б.н., ведущий научный сотрудник лаборатории клеточных гибридов.

Москва

PhD (Biology), Leading Research Associate, Laboratory of Cellular Hybrids, I. Mechnikov Research Institute of Vaccine and Sera.

Moscow

ГавриловаН. Ф.GavrilovaN. F.

К.б.н., старший научный сотрудник лаборатории клеточных гибридов.

Москва

PhD (Biology), Senior Research Associate, Laboratory of Cellular Hybrids, I. Mechnikov Research Institute of Vaccine and Sera.

Moscow

КорноуховаА. А.KornoukhovaA. A.

Младший научный сотрудник лаборатории иммунологической диагностики эндокринных заболеваний.

Москва

Junior Research Associate, Laboratory of Immunological Diagnostics of Endocrine Diseases, I. Mechnikov Research Institute of Vaccine and Sera.

Moscow

СидоровА. В.SidorovA. V.

К.б.н., заведующий лабораторией ДНК-содержащих вирусов.

Москва

PhD (Biology), Head, Laboratory of DNA Viruses, I. Mechnikov Research Institute of Vaccine and Sera.

Moscow

Хрейм УаельБ. В.Khraim WaelB. V.

Аспирант ИБХТН.

Москва

Postgraduate Student, P. Lumumba Peoples’ Friendship University.

Moscow

КузьменкоВ. В.KuzmenkoV. V.

Аспирант ИБХТН.

Москва

Postgraduate Student, P. Lumumba Peoples’ Friendship University.

Moscow

ЗубковаИ. В.ZubkovaI. V.

Врач клинической лабораторной диагностики, межклиническая клинико-диагностическая лаборатория.

Москва

Doctor of Clinical Laboratory Diagnostics, Interclinical Clinical Diagnostic Laboratory, I. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University).

Moscow

ФадеевВ. В.FadeevV. V.

Д.м.н., профессор, член-корр. РАН, заведующий кафедрой эндокринологии.

Москва

PhD, MD (Medicine), Professor, Corresponding Member, Russian Academy of Sciences, Head, Department of Endocrinology, I. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University).

Moscow

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток имени И.И. Мечникова»РоссияI. Mechnikov Research Institute of Vaccine and SeraRussian FederationФГАОУ ВО «Российский университет дружбы народов имени Патриса Лумумбы»РоссияP. Lumumba Peoples’ Friendship UniversityRussian FederationФГБОУ ВО «Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова» Министерства здравоохранения РФ (Сеченовский университет)РоссияI. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University)Russian Federation202421092024265941952Copyright © Зубков А.В., Бутова Л.Г., Кузьмина Н.С., Яковлева И.В., Гаврилова Н.Ф., Корноухова А.А., Сидоров А.В., Хрейм Уаель Б.В., Кузьменко В.В., Зубкова И.В., Фадеев В.В., 20242024Зубков А.В., Бутова Л.Г., Кузьмина Н.С., Яковлева И.В., Гаврилова Н.Ф., Корноухова А.А., Сидоров А.В., Хрейм Уаель Б.В., Кузьменко В.В., Зубкова И.В., Фадеев В.В.Zubkov A.V., Butova L.G., Kuzmina N.S., Yakovleva I.V., Gavrilova N.F., Kornoukhova A.A., Sidorov A.V., Khraim Wael B.V., Kuzmenko V.V., Zubkova I.V., Fadeev V.V.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.mimmun.ru/mimmun/article/view/3099

Во всем мире растет число больных аутоиммунными заболеваниями щитовидной железы (диффузный токсический зоб, аутоиммунный тиреоидит). Важнейшим моментом в диагностике диффузного токсического зоба является выявление аутоантител к рецептору тиреотропного гормона (рТТГ) в сыворотке крови больных. Для дифференциальной диагностики антител к антигенам щитовидной железы перспективно тестирование на основе моноклональных антител к рецептору тиреотропного гормона человека, которые можно получить не только в результате иммунизации животных нативным или рекомбинантным белком рецептора тиреотропного гормона, но и при ДНК-иммунизации генно-инженерными конструкциями, содержащими фрагменты гена рТТГ. На базе мРНК, выделенной нами из ткани щитовидной железы пациентов с диффузным токсическим зобом, клонирован ряд фрагментов гена рецептора тиреотропина, которые могли бы быть пригодны для ДНК-иммунизации животных; оценить один из сконструированных векторов – pVAX1рТТГ (1160) в качестве иммуногена на мышиной модели стало целью настоящей работы. Наличие фрагмента гена рецептора тиреотропного гормона, размером 1160 п.н., который был трансфецирован в составе вектора pVAX1 в клеточную линию СНО, было установлено методами иммуноблоттинга и ИФА. Иммунный ответ, формирующийся на введение мышам линии BALB/с вектора pVAX1, содержащего фрагмент кДНК гена рецептора тиреотропного гормона человека, был выявлен в разных вариантах ИФА. Иммунизация животных ДНК-вектором pVAX1-рTТГ по экспериментально подобранной схеме оказалась эффективной для формирования у опытных животных спленоцитов, секретирующих антитела к рецептору тиреотропного гормона человека, которые были использованы для успешной гибридизации. Это подтверждалось результатами определения антитело – продукции к рецептору тиреотропного гормона человека в сыворотках крови мышей: уровень продукции антител оставался высоким (титр более 1:10 000) на 8-й неделе эксперимента. В результате селекции индивидуальных клонов по критериям пролиферативной активности и стабильности продукции антител были отобраны наиболее стабильные культуры гибридом, секретирующие МкАт против рецептора тиреотропного гормона человека.

The number of patients with autoimmune thyroid diseases (Graves’disease, Hashimoto’sthyroiditis) is increasing globally. The most important part in the diagnosis of Graves’ disease (GD) is the detection of autoantibodies to the thyrotropin receptor (TSHR) in Graves’ patients’ sera. For the differential diagnosis of antibodies to thyroid antigens, it is promising to use tests based on monoclonal antibodies to TSHR, which can be obtained not only as a result of immunization with native or recombinant TSHR protein, but also through DNA immunization with genetically engineered constructs containing fragments of the TSHR gene. Based on mRNA we isolated from the thyroid tissue in GD, a number of fragments of the thyrotropin receptor gene were cloned, suitable for DNA immunization of animals. The purpose of this work is to evaluate the immunogenic properties of one of the constructed vectors, pVAX1-TSHR (1160), in a mouse model. The successful inclusion of the extracellular domain gene fragment of the human TSHR (1160), which was transfected into CHO cells as a part of the pVAX1 vector was confirmed by immunoblotting and ELISA. The immune response formed to the injection of the pVAX1 vector into BALB/c mice, containing a fragment of the human TSHR gene, was detected in different versions of ELISA. Immunization of animals with the DNA vector pVAX1-TSHR according to an experimentally selected scheme was effective for the formation of mouse splenocytes, secreting antibodies to TSHR, which were used for successful hybridization. This was confirmed by the results of determining antibody production to TSHR in murine blood sera. The level of antibody production remained high (titer more than 1:10.000) at the 8th week of the experiment. As a result of selection of individual clones according to the criteria of proliferative activity and stability of antibody production, the most stable cultures secreting mAbs against TSHR were selected.

рТТГДНК-иммунизациямышиная модель аутоиммунного заболеванияМкАт против рТТГаутоантителаиммунный ответTSHRDNA immunizationmouse model of autoimmune diseasemAb against TSHRautoantibodiesimmune responseReferencesЗубков А.В., Андреева М.А., Сидоров А.В., Милованова А.В., Бутова Л.Г. Клонирование гена рецептора тиреотропного гормона человека // Российский иммунологический журнал, 2019. Т. 13 (22), № 2. С. 278-280. doi: 10.31857/S102872210006600-5.Zubkov A.V., Andreeva M.A., Sidorov A.V., Milovanova A.V., Butova L.G. Cloning of the human thyroid-stimulating hormone receptor gene. Rossiyskiy immunologicheskiy zhurnal = Russian Journal of Immunology, 2019, Vol. 13 (22), no. 2, pp. 278-280. (In Russ.) doi: 10.31857/S102872210006600-5.Руководство по лабораторным животным и альтернативным моделям в биомедицинских технологиях. Под ред. Н.Н. Каркищенко и С.В.Грачева. М.: ПРОФИЛЬ-2С, 2010. 358 с.A guide to laboratory animals and alternative models in biomedical technology. Ed. by Karkishchenko N.N. and Gracheva S.V. Moscow: PROFIL-2S, 2010. 358 p.Chen C.R., Pichurin P., Nagayama J. The thyrotropin receptor autoantigen in Graves’ disease is the culprit as well as the victim J. Clin. Invest., 2003, Vol. 111, no. 12, pp. 1897-1904.Chen C.R., Pichurin P., Nagayama J. The thyrotropin receptor autoantigen in Graves’ disease is the culprit as well as the victim J. Clin. Invest., 2003, Vol. 111, no. 12, pp. 1897-1904.Feng K., Zheng X., Wang R. Long-Term Protection Elicited by a DNA Vaccine Candidate Expressing the prM-E Antigen of Dengue Virus Serotype 3 in Mice. Front. Microbiol., 2020, Vol. 10, 87. doi: 10.3389/fcimb.2020.00087.Feng K., Zheng X., Wang R. Long-Term Protection Elicited by a DNA Vaccine Candidate Expressing the prM-E Antigen of Dengue Virus Serotype 3 in Mice. Front. Microbiol., 2020, Vol. 10, 87. doi: 10.3389/fcimb.2020.00087.Gilbert J.A., Kalled S.L., Moorhead J. Treatment of autoimmune hyperthyroidism in murine model Graves’ disease with tumor necrosis factor family ligand ingibitor suggest a key role for B cell activating factor in disease pathohology. Endocrinology, 2006, Vol. 147, no. 10, pp. 4561-4568.Gilbert J.A., Kalled S.L., Moorhead J. Treatment of autoimmune hyperthyroidism in murine model Graves’ disease with tumor necrosis factor family ligand ingibitor suggest a key role for B cell activating factor in disease pathohology. Endocrinology, 2006, Vol. 147, no. 10, pp. 4561-4568.Jansson L., Vrolix K., Jahraus A. Immunotherapy with apitopes blocks the immune response to TSH receptor in HLA-DR transgenic mice. Endocrinology, 2018, Vol. 159, no. 9, pp. 3446-3457.Jansson L., Vrolix K., Jahraus A. Immunotherapy with apitopes blocks the immune response to TSH receptor in HLA-DR transgenic mice. Endocrinology, 2018, Vol. 159, no. 9, pp. 3446-3457.Lerner A., Jeremias P., Matthias T. The world incidence and prevalence of autoimmune diseases is increasing. Int. J. Celiac Dis., 2015, Vol. 3, no. 4, pp. 151-155.Lerner A., Jeremias P., Matthias T. The world incidence and prevalence of autoimmune diseases is increasing. Int. J. Celiac Dis., 2015, Vol. 3, no. 4, pp. 151-155.Moshkelgosha S., So P.W., Deasy N. Cutting edge: Retrobulbar inflammation, adipogenesis, and acute orbital congestion in a preclinical female mouse model of graves’ orbitopathy induced by thyrotropin receptorplasmid-in vivo electroporation. Endocrinology, 2013, Vol. 154, pp. 3008-3015.Moshkelgosha S., So P.W., Deasy N. Cutting edge: Retrobulbar inflammation, adipogenesis, and acute orbital congestion in a preclinical female mouse model of graves’ orbitopathy induced by thyrotropin receptorplasmid-in vivo electroporation. Endocrinology, 2013, Vol. 154, pp. 3008-3015.Rapoport B., McLachlan S.M. TSH receptor cleavage into subunits and shedding of the A-subunit; a molecular and clinical perspective. Endocr. Rev., 2016, Vol. 37, no. 2, pp. 114-134.Rapoport B., McLachlan S.M. TSH receptor cleavage into subunits and shedding of the A-subunit; a molecular and clinical perspective. Endocr. Rev., 2016, Vol. 37, no. 2, pp. 114-134.Peng J., Xiao Y., Wan X. Enhancement of Immune response and anti-infection of mice by porcine antimicrobial peptides and interleukin-4/6 fusion gene encapsulated in chitosan nanoparticles. Vaccine, 2020, Vol. 8, 552. doi: 10.3390/vaccines8030552.Peng J., Xiao Y., Wan X. Enhancement of Immune response and anti-infection of mice by porcine antimicrobial peptides and interleukin-4/6 fusion gene encapsulated in chitosan nanoparticles. Vaccine, 2020, Vol. 8, 552. doi: 10.3390/vaccines8030552.Schluter A., Horstmann M., Diaz-Cano S. Genetic immunization with mouse thyrotropin hormonereceptor plasmid breaks self tolerance for a murine model of autoimmune thyroid disease and Graves’ orbitopathy. Clin. Exp. Immunol., 2017, Vol. 191, pp. 255-267.Schluter A., Horstmann M., Diaz-Cano S. Genetic immunization with mouse thyrotropin hormonereceptor plasmid breaks self tolerance for a murine model of autoimmune thyroid disease and Graves’ orbitopathy. Clin. Exp. Immunol., 2017, Vol. 191, pp. 255-267.Sonaimuthu P., Ching X.T., Fong M.Y. Induction of protective immunity against toxoplasmosis in BALB/c mice vaccinated with toxoplasma gondii rhoptry. Front. Microbiol. 2016, Vol. 7, 808. doi: 10.3389/fmicb.2016.00808.Sonaimuthu P., Ching X.T., Fong M.Y. Induction of protective immunity against toxoplasmosis in BALB/c mice vaccinated with toxoplasma gondii rhoptry. Front. Microbiol. 2016, Vol. 7, 808. doi: 10.3389/fmicb.2016.00808.Towbin H., Stachelin T., Gardon J. Electrophoretic transfer of protein from polyacrylamide gel stonitrocellulose sheets. Procedures and some applications. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 1979, Vol. 76, pp. 4350-4354.Towbin H., Stachelin T., Gardon J. Electrophoretic transfer of protein from polyacrylamide gel stonitrocellulose sheets. Procedures and some applications. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 1979, Vol. 76, pp. 4350-4354.Weetman A.P, Jateman M.E, Ealey P.A. Thyroid stimulating antibody activity between different immunoglobulin G subclasses. J. Clin. Invest., 1990, Vol. 86, no. 3, pp. 723-727.Weetman A.P, Jateman M.E, Ealey P.A. Thyroid stimulating antibody activity between different immunoglobulin G subclasses. J. Clin. Invest., 1990, Vol. 86, no. 3, pp. 723-727.Zheng B., Ding J., Chen X. Immuno efficacy of a t. Gondii secreted protein with an altered thrombospondin repeat (TgSPATR) as a novel DNA vaccine candidate against acute toxoplasmosis in BALB/c mice. Front. Microbiol., 2017, Vol. 8, 216. doi: 10.3389/fmicb.2017.00216.Zheng B., Ding J., Chen X. Immuno efficacy of a t. Gondii secreted protein with an altered thrombospondin repeat (TgSPATR) as a novel DNA vaccine candidate against acute toxoplasmosis in BALB/c mice. Front. Microbiol., 2017, Vol. 8, 216. doi: 10.3389/fmicb.2017.00216.Zheng X., Chen H., Wang R. Effective Protection induced by a monovalent DNA vaccine against Dengue Virus (DV) serotype 1 and a bivalent DNA vaccine against DV1 and DV2 in Mice. Front. Cell. Infect. Microbiol., 2017, Vol. 7, 175. doi: 10.3389/fcimb.2017.00175.Zheng X., Chen H., Wang R. Effective Protection induced by a monovalent DNA vaccine against Dengue Virus (DV) serotype 1 and a bivalent DNA vaccine against DV1 and DV2 in Mice. Front. Cell. Infect. Microbiol., 2017, Vol. 7, 175. doi: 10.3389/fcimb.2017.00175.Zheng X., Yu X., Wang Y. Complete protection for mice conferred by a DNA vaccine based on the Japanese encephalitis virus P3 strain used to prepare the inactivated vaccine in China. Virol. J., 2020, Vol. 17, 126. doi.org/10.1186/s12985-020-01400-3.Zheng X., Yu X., Wang Y. Complete protection for mice conferred by a DNA vaccine based on the Japanese encephalitis virus P3 strain used to prepare the inactivated vaccine in China. Virol. J., 2020, Vol. 17, 126. doi.org/10.1186/s12985-020-01400-3.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.