mimmunМедицинская иммунологияMedical Immunology (Russia)1563-06252313-741XSPb RAACI10.15789/1563-0625-EOI-16894mimmun-3093Research ArticleКРАТКИЕ СООБЩЕНИЯSHORT COMMUNICATIONSЭкспрессия маркеров контрольных точек иммунного ответа лимфоцитами периферической крови у женщин с фиброаденомой молочной железыExpression of immune checkpoint markers in peripheral blood lymphocytes of women with fibroadenoma of the breastКурмышкинаО. В.KurmyshkinaO. V.

Курмышкина Ольга Вадимовна – к.б.н., доцент кафедры биомедицинской химии, иммунологии и лабораторной диагностики.

185910, Петрозаводск, пр. Ленина, 33

Тел.: 8 (8142) 78-46-97

Olga V. Kurmyshkina - PhD (Biology), Associate Professor, Department of Biomedical Chemistry, Immunology, and Laboratory Diagnostics, Petrozavodsk State University.

33 Lenin St Petrozavodsk 185910

Phone: +7 (8142) 78-46-97

VolkovaTO@yandex.ruКуликовскаяТ. М.KulikovskayaT. M.

К.м.н., доцент кафедры общей и факультетской хирургии.

Петрозаводск

PhD (Medicine), Associate Professor, Department of General and Faculty Surgery, Petrozavodsk State University.

Petrozavodsk

ВолковаТ. О.VolkovaT. O.

Д.б.н., доцент, заведующая кафедрой биомедицинской химии, иммунологии и лабораторной диагностики.

Петрозаводск

PhD, MD (Biology), Associate Professor, Head, Department of Biomedical Chemistry, Immunology, and Laboratory Diagnostics, Petrozavodsk State University.

Petrozavodsk

ФГБОУ ВО «Петрозаводский государственный университет»РоссияPetrozavodsk State UniversityRussian Federation202421092024265975982Copyright © Курмышкина О.В., Куликовская Т.М., Волкова Т.О., 20242024Курмышкина О.В., Куликовская Т.М., Волкова Т.О.Kurmyshkina O.V., Kulikovskaya T.M., Volkova T.O.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.mimmun.ru/mimmun/article/view/3093

Изменения иммунного статуса при фиброаденоме (ФА) и других доброкачественных патологиях молочной железы – малоисследованный вопрос, равно как и участие регуляторов контрольных точек иммунного ответа (КИТ) в патогенезе данной группы заболеваний. Целью работы являлось сравнение уровня экспрессии маркеров КИТ CD279/PD-1, CD274/PD-L1, CD366/TIM3 и CD223/ LAG3 в общей популяции лимфоцитов, ее Т-клеточного звена и, в отдельности, CD4 и CD8 субпопуляций в периферической крови женщин с ФА и здоровых доноров. Образцы периферической крови были получены от 12 женщин с диагнозом фиброаденома молочной железы (23-54 лет) и 15 здоровых женщин (22-52 лет), составивших группу контроля. Забор крови в группе больных производился непосредственно перед хирургической операцией, далее образцы анализировались методом мультипараметрической проточной цитометрии с использованием моноклональных антител: CD3-VioBlue, CD4/CD8-FITC, PD1-PE, PD-L1-PerCP-Cy.5.5, TIM3/LAG3-APC. Каждый образец инкубировался с 4 комбинациями антител: CD3/CD4/PD1/PD-L1/TIM3, CD3/CD4/PD1/PD-L1/LAG3, CD3/CD8/ PD1/PD-L1/TIM3, CD3/CD8/PD1/PD-L1/LAG3. Была проведена оценка моноэкспрессии каждого из 4-х маркеров контрольных иммунных точек (КИТ) в лимфоцитарном гейте обеих групп. В образцах крови группы ФА получено значимое увеличение экспрессии PD-L1, выраженной в % окрашенных клеток и приросте интенсивности флуоресценции. При анализе моноэкспрессии КИТ в популяции CD3+Т-лимфоцитов, кроме достоверного увеличения % PD-L1+, также обнаружено повышение доли PD1+Т-клеток в группе ФА. В отношении различий между изменениями моноэкспрессии КИТ в CD4+ и CD8+ Т-клеточном звене, в группе ФА наблюдалось более выраженное увеличение доли CD8+PD1+Т-клеток, по сравнению с CD4. Характер изменений PD-L1 был сопоставим для CD4 и CD8 субпопуляций (в обоих случаях достоверное увеличение в группе ФА). Были проанализированы изменения профиля коэкспрессии двух КИТ в CD4+ и CD8+ звене Т-клеток. Наиболее заметным оказалось увеличение частоты фенотипа PD1+PD-L1+ в обеих субпопуляциях Т-клеток при сравнении ФА и группы контроля. В отношении совместной экспрессии трех маркеров КИТ в CD4 и CD8 субпопуляциях, было получено достоверное увеличение %-доли PD1+PD-L1+TIM3+ клеток среди CD4 Т-хелперов. Таким образом, в системной циркуляции женщин с диагнозом ФА могут наблюдаться специфические изменения фенотипа Т-клеток, связанные с (ко-)экспрессией регуляторов КИТ.

Changes of the immune state in patients with fibroadenoma (FA) or other benign lesions of the breast, as well as the involvement of immune checkpoints in pathogenesis of these lesions, remain underexplored. The aim of this study was to compare the expression level of the key immune checkpoint markers CD279/PD-1, CD274/PD-L1, CD366/TIM3, and CD223/LAG3 in total circulating lymphocytes, T cell population as well as in its CD4 and CD8 subsets in peripheral blood from women with breast FA and healthy controls. Blood samples were taken from 12 women diagnosed with FA of the breast (aged 23-54 years, FA group) and 15 healthy women (aged 22-52 years, control group). Sample uptake was performed immediately before surgery, and samples were further analyzed by multicolor flow cytometry using monoclonal antibodies CD3-VioBlue, CD4/CD8-FITC, PD1-PE, PD-L1-PerCP-Cy.5.5, and TIM3/LAG3-APC. Each sample was incubated with 4 antibody combinations: CD3/CD4/PD1/PD-L1/TIM3, CD3/CD4/PD1/PD-L1/LAG3, CD3/CD8/PD1/PD-L1/TIM3, and CD3/CD8/PD1/PD-L1/LAG3. First, mono-expression of each of the 4 immune checkpoint markers was evaluated in the lymphocyte gate from both investigated groups. In FA samples, a significant increase in PD-L1 expression (assessed as percent of positive cells and fluorescence intensity change) was observed. Regarding expression of immune checkpoints in CD3+ T cells, along with significantly increased %PD-L1+, elevated numbers of PD1+T cells were detected. As for the differences in immune checkpoint expression changes between CD4+ and CD8+ T cell subsets, FA patient group demonstrated a more prominent increase in the amount of CD8+PD1+T cells relative to CD4 subset. The profiles of PD-L1 changes in CD4 and CD8 subpopulations were comparable showing, in both cases, a significant increase in FA sample group. We also analyzed changes in co-expression of any two immune checkpoint markers in CD4+ and CD8+ T cell subsets. The most noticeable was as increase in the prevalence of PD1+PD-L1+ phenotype in both T cell subpopulations from FA patients compared to the controls. With respect to co-expression of 3 checkpoint markers in CD4+ and CD8+ T cells, a significant increase in the percentage of PD1+PD-L1+TIM3+ cells among CD4 T helpers was found in FA. Thus, specific changes of T cell phenotype related to (co-)expression of immune checkpoint regulators may occur in systemic circulation of women with breast FA.

фиброаденома молочной железыконтрольные точки иммунного ответалимфоциты периферической кровипроточная цитометриякоэкспрессияиммунорегуляцияfibroadenoma of the breastimmune checkpointsperipheral blood lymphocytesflow cytometryco-expressionimmune regulationReferencesAdhikary S., Hoskin T.L., Stallings-Mann M.L., Arshad M., Frost M.H., Winham S.J., Peña A., Lee D.J., Murphy L.M., Rakoff M. Cytotoxic T cell depletion with increasing epithelial abnormality in women with benign breast disease. Breast Cancer Res. Treat., 2020, Vol. 180, no. 1, pp. 55-61.Adhikary S., Hoskin T.L., Stallings-Mann M.L., Arshad M., Frost M.H., Winham S.J., Peña A., Lee D.J., Murphy L.M., Rakoff M. Cytotoxic T cell depletion with increasing epithelial abnormality in women with benign breast disease. Breast Cancer Res. Treat., 2020, Vol. 180, no. 1, pp. 55-61.Chen Z., Zhang Y., Li W., Gao C., Huang F., Cheng L., Jin M., Xu X., Huang J. Single cell profiling of female breast fibroadenoma reveals distinct epithelial cell compositions and therapeutic targets. Nat. Commun., 2023, Vol. 14, no. 1, 3469. doi: 10.1038/s41467-023-39059-3.Chen Z., Zhang Y., Li W., Gao C., Huang F., Cheng L., Jin M., Xu X., Huang J. Single cell profiling of female breast fibroadenoma reveals distinct epithelial cell compositions and therapeutic targets. Nat. Commun., 2023, Vol. 14, no. 1, 3469. doi: 10.1038/s41467-023-39059-3.Guan H., Wan Y., Lan J., Wang Q., Wang Z., Li Y., Zheng J., Zhang X., Wang Z., Shen Y., Xie F. PD-L1 is a critical mediator of regulatory B cells and T cells in invasive breast cancer. Sci. Rep., 2016, no. 6, 35651. doi: 10.1038/srep35651.Guan H., Wan Y., Lan J., Wang Q., Wang Z., Li Y., Zheng J., Zhang X., Wang Z., Shen Y., Xie F. PD-L1 is a critical mediator of regulatory B cells and T cells in invasive breast cancer. Sci. Rep., 2016, no. 6, 35651. doi: 10.1038/srep35651.Hou H., Lyu Y., Jiang J., Wang M., Zhang R., Liew C.C., Wang B., Cheng C. Peripheral blood transcriptome identifies high-risk benign and malignant breast lesions. PLoS One, 2020, Vol. 15, no. 6, e0233713. doi: 10.1371/journal.pone.0233713.Hou H., Lyu Y., Jiang J., Wang M., Zhang R., Liew C.C., Wang B., Cheng C. Peripheral blood transcriptome identifies high-risk benign and malignant breast lesions. PLoS One, 2020, Vol. 15, no. 6, e0233713. doi: 10.1371/journal.pone.0233713.Li X., Vail E., Maluf H., Chaum M., Leong M., Lownik J., Che M., Giuliano A., Cao D., Dadmanesh F. Gene Expression Profiling of Fibroepithelial Lesions of the Breast. Int. J. Mol. Sci., 2023, Vol. 24, no. 10, 9041. doi: 10.3390/ijms24109041.Li X., Vail E., Maluf H., Chaum M., Leong M., Lownik J., Che M., Giuliano A., Cao D., Dadmanesh F. Gene Expression Profiling of Fibroepithelial Lesions of the Breast. Int. J. Mol. Sci., 2023, Vol. 24, no. 10, 9041. doi: 10.3390/ijms24109041.Md Nasir N.D., Ng C.C.Y., Rajasegaran V., Wong S.F., Liu W., Ng G.X.P. International Fibroepithelial Consortium; Tan P., Teh B.T., Tan P.H. Genomic characterisation of breast fibroepithelial lesions in an international cohort. J. Pathol., 2019, Vol. 249, no. 4, pp. 447-460.Md Nasir N.D., Ng C.C.Y., Rajasegaran V., Wong S.F., Liu W., Ng G.X.P. International Fibroepithelial Consortium; Tan P., Teh B.T., Tan P.H. Genomic characterisation of breast fibroepithelial lesions in an international cohort. J. Pathol., 2019, Vol. 249, no. 4, pp. 447-460.Ogony J., Hoskin T.L., Stallings-Mann M., Winham S., Brahmbhatt R., Arshad M.A., Kannan N., Peña A., Allers T., Brown A. Immune cells are increased in normal breast tissues of BRCA1/2 mutation carriers. Breast Cancer Res. Treat., 2023, Vol. 197, no. 2, pp. 277-285.Ogony J., Hoskin T.L., Stallings-Mann M., Winham S., Brahmbhatt R., Arshad M.A., Kannan N., Peña A., Allers T., Brown A. Immune cells are increased in normal breast tissues of BRCA1/2 mutation carriers. Breast Cancer Res. Treat., 2023, Vol. 197, no. 2, pp. 277-285.Sinha I., Fogle R.L., Gulfidan G., Stanley A.E., Walter V., Hollenbeak C.S., Arga K.Y., Sinha R. Potential Early Markers for Breast Cancer: A Proteomic Approach Comparing Saliva and Serum Samples in a Pilot Study. Int. J. Mol. Sci., 2023, Vol. 24, no. 4, 4164. doi: 10.3390/ijms24044164.Sinha I., Fogle R.L., Gulfidan G., Stanley A.E., Walter V., Hollenbeak C.S., Arga K.Y., Sinha R. Potential Early Markers for Breast Cancer: A Proteomic Approach Comparing Saliva and Serum Samples in a Pilot Study. Int. J. Mol. Sci., 2023, Vol. 24, no. 4, 4164. doi: 10.3390/ijms24044164.Winham S.J., Wang C., Heinzen E.P., Bhagwate A., Liu Y., McDonough S.J., Stallings-Mann M.L., Frost M.H., Vierkant R.A., Denison L.A. Somatic mutations in benign breast disease tissues and association with breast cancer risk. BMC Med. Genomics., 2021, Vol. 14, no. 1, 185. doi: 10.1186/s12920-021-01032-8.Winham S.J., Wang C., Heinzen E.P., Bhagwate A., Liu Y., McDonough S.J., Stallings-Mann M.L., Frost M.H., Vierkant R.A., Denison L.A. Somatic mutations in benign breast disease tissues and association with breast cancer risk. BMC Med. Genomics., 2021, Vol. 14, no. 1, 185. doi: 10.1186/s12920-021-01032-8.Yin Lee J.P., Thomas A.J., Lum S.K., Shamsudin N.H., Hii L.W., Mai C.W., Wong S.F., Leong C.O. Gene expression profiling of giant fibroadenomas of the breast. Surg. Oncol., 2021, no. 37, 101536. doi: 10.1016/j.suronc.2021.101536.Yin Lee J.P., Thomas A.J., Lum S.K., Shamsudin N.H., Hii L.W., Mai C.W., Wong S.F., Leong C.O. Gene expression profiling of giant fibroadenomas of the breast. Surg. Oncol., 2021, no. 37, 101536. doi: 10.1016/j.suronc.2021.101536.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.