mimmunМедицинская иммунологияMedical Immunology (Russia)1563-06252313-741XSPb RAACI10.15789/1563-0625-PCO-3068mimmun-3068Research ArticleОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИORIGINAL ARTICLESФенотипические характеристики натуральных киллеров после генерации и активации in vitroPhenotypic characteristics of natural killer cells after their generation and activation in vitrohttps://orcid.org/0000-0002-3881-3221АбакушинаЕ. В.AbakushinaE. V.

Абакушина Е.В. – д.м.н., руководитель отдела по разработке и исследованиям в области иммунологии, заместитель генерального директора 

123298, Москва, ул. 3-я Хорошевская, 16, корп. 2.

Abakushina E.V., PhD, MD (Medicine), Head, Department for Development and Research in the Field of Immunology, Deputy General Director 

16, 3rd Khoroshevskaya St, Bldg 2 Moscow 123298

abakushina@tecon.ruhttps://orcid.org/0000-0003-1084-690XЖуриковР. В.ZhurikovR. V.

Журиков Р.В. – научный сотрудник отдела по разработке и исследованиям в области иммунологии 

123298, Москва, ул. 3-я Хорошевская, 16, корп. 2.

Zhurikov R.V., Research Associate, Department for Development and Research in the Field of Immunology 

16, 3rd Khoroshevskaya St, Bldg 2 Moscow 123298

zhurikov@tecon.ruhttps://orcid.org/0009-0001-4572-0592БалышеваК. Д.BalyshevaK. D.

Балышева К.Д. – лаборант-исследователь отдела по разработке и исследованиям в области иммунологии

123298, Москва, ул. 3-я Хорошевская, 16, корп. 2.

Balysheva K.D., Research Assistant, Department for Development and Research in the Field of Immunology 

16, 3rd Khoroshevskaya St, Bldg 2 Moscow 123298

balysheva@tecon.ruhttps://orcid.org/0009-0007-9606-8833БекетоваМ. В.BeketovaM. V.

Бекетова М.В. – лаборант-исследователь отдела по разработке и исследованиям в области иммунологии

123298, Москва, ул. 3-я Хорошевская, 16, корп. 2.

Beketova M.V., Research Assistant, Department for Development and Research in the Field of Immunology 

16, 3rd Khoroshevskaya St, Bldg 2 Moscow 123298

beketova@tecon.ruhttps://orcid.org/0000-0002-7418-0222РумянцевС. А.RumyantsevS. A.

Румянцев С.А. – д.м.н., профессор, заведующий отделом молекулярной онкологии и иммунологии 

Москва

Rumyantsev S.A., PhD, MD (Medicine), Professor, Head, Department of Molecular Oncology and Immunology 

Moscow

s_roumiantsev@mail.ruООО «Текон Медицинские Приборы»РоссияLLC “Tecon MP”Russian FederationГНЦ РФ ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр эндокринологии» Министерства здравоохранения РФРоссияNational Medical Research Center of EndocrinologyRussian Federation202507102024272297302Copyright © Абакушина Е.В., Журиков Р.В., Балышева К.Д., Бекетова М.В., Румянцев С.А., 20252025Абакушина Е.В., Журиков Р.В., Балышева К.Д., Бекетова М.В., Румянцев С.А.Abakushina E.V., Zhurikov R.V., Balysheva K.D., Beketova M.V., Rumyantsev S.A.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.mimmun.ru/mimmun/article/view/3068

За счет разработки эффективных методов активации и генерации натуральных киллеров in vitro современныe способы адоптивной иммунотерапии онкологических больных получили новое развитие. Целью данного исследования явилось изучение экспрессии маркеров активации на натуральных киллерах после генерации и активации in vitro с помощью проточной цитометрии. Мононуклеарные клетки выделяли из периферической крови 10 доноров на градиенте плотности и культивировали в среде RPMI-1640 (Sigma-Aldrich, Германия) с добавлением IL-2 и клеток TMDК562-15 в течение 14 дней. Цитофлуориметрический анализ проводили на 0-й, 7-й и 14-й дни культивирования на цитометре Image Stream MkII (Luminex, США). Применяли 10-цветную панель моноклональных меченых антител к СD45, СD3, СD56, СD16 и маркерам активации CD38/HLA-DR/CD25 (BD Biosciences, США). Цитотоксическую активность натуральных киллеров, полученных от доноров, оценивали на 14-й день культивирования в отношении опухолевых мишеней AsPC-1, А-549, MDA-MB-231 и PC-3, при соотношении «эффектор:мишень» 5:1 и 10:1 в течение 12 часов. Статистический анализ осуществляли с помощью MS Excel 2016, TIBCO STATISTICA 11. До начала культивирования доля натуральных киллеров в составе мононуклеарных клеток составляла в среднем 12%, из которых CD38/HLA-DR/CD25 экспрессировали 7,6%, 0,7%, 0%. Длительное культивирование мононуклеарных клеток in vitro привело к активации и изменению доли субпопуляций лимфоцитов. Количество натуральных киллеров на 14-й день культивирования увеличилось в 390 раз, и доля натуральных киллеров составила 86,5%. Среди них на 14-й день культивации активационные рецепторы CD38/HLA-DR/CD25 экспрессировали соответственно 34,7%, 36,5%, 5% натуральных киллеров. При изучении цитотоксичности полученных натуральных киллеров по отношению к клеткам различных опухолевых линий через 12 часов после внесения натуральных киллеров наблюдали 100% лизис клеток-мишеней. Жизнеспособность клеток у всех доноров была более 98%, на 7-й день несколько снижалась и в среднем составляла 81%, к окончанию культивирования показатель достигал уровня более 95%. Предложенный способ культивирования мононуклеарных клеток позволяет значительно увеличить пролиферативную активность и экспрессию активационных маркеров натуральных киллеров при сохранении высокой жизнеспособности популяции, полученной в процессе культивирования. Функциональная активность натуральных киллеров подтверждается в цитотоксическом тесте по отношению к клеткам опухолевых линий.

The development of new effective methods for in vitro activation and culturing of natural killer (NK) cells led to advances in adoptive cancer immunotherapy. Our aim was to evaluate expression of activation markers on natural killer cells after cultivation and activation in vitro using flow cytometry. Peripheral blood mononuclear cells were isolated from heparinized blood of 10 donors in a density gradient and were cultivated in RPMI-1640 medium (Sigma-Aldrich, Germany) supplied with IL-2 and TMDK562-15 feeder cells for 14 days. Phenotyping of the NK cells was carried out using an Image Stream MkII (Luminex) flow cytometer. We used a cytometry panel containing 10 monoclonal antibodies against СD45, СD3, СD56, СD16, and against cell activation markers, i.e., CD38/HLA-DR/CD25 (BD Biosciences). Cytotoxic activity of the donor-derived NK cells was tested towards cancer cell lines AsPC-1, A-549, MDA-MB-231 and PC-3 on 14th day of cultivation. The effector-to-target ratios were 5:1 and 10:1. The target cells were exposed to effector cells for 12 hours. Statistical analysis was performed using MS Excel 2016, TIBCO STATISTICA 13. Prior to cultivation, the percentage of natural killer cells in mononuclear cells was 12%. Of those, activation markers (CD38/HLA-DR/CD25) were expressed, accordingly, on 7.6%, 0.7%, 0% cells, Cultivation of mononuclear cells for 14 days resulted in activation and expansion of distinct lymphocyte subpopulations. NK cell counts increased 390-fold on 14th day of cultivation, with percentage of natural killers reaching 86.5%. On the 14th day of cultivation, expression levels of activation markers (CD38/HLA-DR/CD25) were 34.7%, 36.5%, 5%, accordingly. Studying the cytotoxic activity of NK cells against different cancer cell lines showed that, after 12-h incubation of activated cells with target cells, 100% of cancer cells have been lysed. The donor cells were viable by 98%. After 7 days of cultivation, the cell viability decreased to 81%; at the end of cultures, their viability was 95%. The suggested cultivation technique for mononuclear cells cause an increase of proliferative activity and expression of activation markers of NK cells, thus allowing to maintain high viability of the cell population. High functional activity of cultured NK cells was confirmed in cytotoxicity tests against cancer cells.

адоптивная терапиянатуральные киллерымаркеры NK-клетокгенерация NK-клетокфенотипadoptive therapynatural killer cellsNK cell markersNK cell cultivationphenotypeReferencesАбакушина Е.В. Рекомбинантная клеточная линия TMDK562-15, проявляющая способность к активации и пролиферации ЕК клеток человека. Патент RU 2803178 C1, 07.09.2023.Abakushina E.V. Recombinant cell line TMDK562-15 capable of activation and proliferation of human NK-cells. Patent RU 2803178 C1, 07.09.2023.Абакушина Е.В. Метод проточной цитометрии для оценки NK-клеток и их активности // Клиническая лабораторная диагностика, 2015. Т. 60, № 11. C. 37-44.Abakushina E.V. Flow cytometry method for evaluation of NK-cells and their activity. Klinichescheskaya laboratornaya diagnostika = Russian Clinical Laboratory Diagnostics, 2015, Vol. 60, no. 11, pp. 37-44. (In Russ.)Абакушина Е.В., Козлов И.Г. Иммунотерапия с использованием естественных киллеров в лечении онкологических заболеваний // Российский иммунологический журнал, 2016. Т. 10, № 2. С. 131-142.Abakushina E.V., Kozlov I.G. NK-cells immunotherapy in treatment of oncological diseases. Rossiyskiy immunologicheskiy zhurnal = Russian Journal of Immunology, 2016, Vol. 10, no. 2, pp. 131-142. (In Russ.)Абакушина Е.В., Маризина Ю.В., Каприн А.Д. Морфо-функциональная характеристика лимфоцитов человека после активации in vitro // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2016. Т. 161, № 5. С. 678-683.Abakushina E.V., Marizina U.V., Kaprin A.D. Morphofunctional Characteristics of human lymphocytes after in vitro. Byulleten eksperimentalnoy biologii i meditsiny = Bulletin of Experimental Biology and Medicine, 2016, Vol. 161, no. 5, pp. 731-735. (In Russ.)Bald T., Krummel M.F., Smyth M.J., Barry K.C. The NK cell–cancer cycle: advances and new challenges in NK cell–based immunotherapies. Nat. Immunol., 2020, Vol. 21, no. 8, pp. 835-847.Bald T., Krummel M.F., Smyth M.J., Barry K.C. The NK cell–cancer cycle: advances and new challenges in NK cell–based immunotherapies. Nat. Immunol., 2020, Vol. 21, no. 8, pp. 835-847.Kiessling, R., Klein E., Wigzell H. “Natural” killer cells in the mouse. I. Cytotoxic cells with specificity for mouse Moloney leukemia cells. Specificity and distribution according to genotype. Eur. J. Immunol., 1975, vol. 5, no. 2, pp. 112-117.Kiessling, R., Klein E., Wigzell H. “Natural” killer cells in the mouse. I. Cytotoxic cells with specificity for mouse Moloney leukemia cells. Specificity and distribution according to genotype. Eur. J. Immunol., 1975, vol. 5, no. 2, pp. 112-117.Klimpel G.R., Niesel D.W., Klimpel K.D. Natural cytotoxic effector cell activity against Shigella flexneri-infected HeLa cells. J. Immunol., 1986, Vol. 136, no. 3, pp 1081-1086.Klimpel G.R., Niesel D.W., Klimpel K.D. Natural cytotoxic effector cell activity against Shigella flexneri-infected HeLa cells. J. Immunol., 1986, Vol. 136, no. 3, pp 1081-1086.Lamers-Kok N., Panella D., Georgoudaki A.M., Liu H., Özkazanc D., Kučerová L., Duru A.D., Spanholtz J., Raimo M. Natural killer cells in clinical development as non-engineered, engineered, and combination therapies. J. Hematol. Oncol., 2022, Vol. 15, no. 1, 164. doi: 10.1186/s13045-022-01382-5.Lamers-Kok N., Panella D., Georgoudaki A.M., Liu H., Özkazanc D., Kučerová L., Duru A.D., Spanholtz J., Raimo M. Natural killer cells in clinical development as non-engineered, engineered, and combination therapies. J. Hematol. Oncol., 2022, Vol. 15, no. 1, 164. doi: 10.1186/s13045-022-01382-5.Macfarlan R.I., Burns W.H., White D.O. Two cytotoxic cells in peritoneal cavity of virus-infected mice: antibody-dependent macrophages and nonspecific killer cells. J. Immunol., 1977, Vol. 119, no. 5, pp. 1569-1574.Macfarlan R.I., Burns W.H., White D.O. Two cytotoxic cells in peritoneal cavity of virus-infected mice: antibody-dependent macrophages and nonspecific killer cells. J. Immunol., 1977, Vol. 119, no. 5, pp. 1569-1574.Melaiu O., Lucarini V., Cifaldi L., Fruci D. Influence of the Tumor Microenvironment on NK Cell Function in Solid Tumors. Front. Immunol., 2019, Vol. 10, 3038. doi: 10.3389/fimmu.2019.03038.Melaiu O., Lucarini V., Cifaldi L., Fruci D. Influence of the Tumor Microenvironment on NK Cell Function in Solid Tumors. Front. Immunol., 2019, Vol. 10, 3038. doi: 10.3389/fimmu.2019.03038.Ortaldo J.R., Oldham R.K., Cannon G.C., Herberman R.B. Specificity of natural cytotoxic reactivity of normal human lymphocytes against a myeloid leukemia cell line. J. Natl Cancer Inst., 1977, Vol. 59, no. 1, pp. 77-82.Ortaldo J.R., Oldham R.K., Cannon G.C., Herberman R.B. Specificity of natural cytotoxic reactivity of normal human lymphocytes against a myeloid leukemia cell line. J. Natl Cancer Inst., 1977, Vol. 59, no. 1, pp. 77-82.Shimasaki N., Jain A., Campana D. NK cells for cancer immunotherapy. Nat. Rev. Drug Discov., 2020, Vol. 19, pp. 200-218.Shimasaki N., Jain A., Campana D. NK cells for cancer immunotherapy. Nat. Rev. Drug Discov., 2020, Vol. 19, pp. 200-218.Voigt J., Malone D.F.G., Dias J., Leeansyah E., Björkström N.K., Ljunggren H.-G., Gröbe L., Klawonn F., Heyner M., Sandberg J.K. Proteome analysis of human CD56neg NK cells reveals a homogeneous phenotype surprisingly similar to CD56dim NK cells. Eur. J. Immunol., 2018, Vol. 48, pp. 1456-1469.Voigt J., Malone D.F.G., Dias J., Leeansyah E., Björkström N.K., Ljunggren H.-G., Gröbe L., Klawonn F., Heyner M., Sandberg J.K. Proteome analysis of human CD56neg NK cells reveals a homogeneous phenotype surprisingly similar to CD56dim NK cells. Eur. J. Immunol., 2018, Vol. 48, pp. 1456-1469.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.