mimmunМедицинская иммунологияMedical Immunology (Russia)1563-06252313-741XSPb RAACI10.15789/1563-0625-COI-16929mimmun-3036Research ArticleКРАТКИЕ СООБЩЕНИЯSHORT COMMUNICATIONSСравнение in vitro моделей для исследования сенесцентных опухоль-ассоциированных макрофагов“Comparison of in vitro models for the study of senescence of macrophages associated with a tumorПухальскаяТ. В.PukhalskaiaT. V.

Пухальская Тамара Владимировна - студент магистратуры, 354340, Краснодарский край, Федеральная территория «Сириус», Олимпийский пр., 1;

старший лаборант, Санкт-Петербург;

старший лаборант-исследователь, Москва

Tamara V. Pukhalskaia - Graduate Student, 1 Olympic Ave Federal Territory Sirius Krasnodar Region 354340;

Senior Laboratory Assistant, St. Petersburg;

Senior Research Assistant, Moscow

tomapukhalskaya@gmail.comЮраковаТ. Р.YurakovaT. R.

старший инженер-исследователь,

Москва

Senior Research Engineer, 

Moscow

МихайловскаяВ. С.MikhailovskayaV. S.

студент магистратуры, 354340, Краснодарский край, Федеральная территория «Сириус», Олимпийский пр., 1

Graduate Student, 

1 Olympic Ave Federal Territory Sirius Krasnodar Region 354340

БогдановаД. А.BogdanovaD. A.

младший научный сотрудник, 354340, Краснодарский край, Федеральная территория «Сириус», Олимпийский пр., 1;

младший научный сотрудник, Санкт-Петербург

Postgraduate Student, Junior Research Associate, 1 Olympic Ave Federal Territory Sirius Krasnodar Region 354340;

Junior Research Associate, St. Petersburg

ДемидовО. Н.DemidovO. N.

профессор, 354340, Краснодарский край, Федеральная территория «Сириус», Олимпийский пр., 1;

д.м.н., профессор, ведущий научный сотрудник, Санкт-Петербург

Professor, 1 Olympic Ave Federal Territory Sirius Krasnodar Region 354340;

PhD, MD (Medicine), Professor, Senior Research Associate, St. Petersburg

АНОО ВО «Научно-технологический университет “Сириус”»; Институт цитологии Российской академии наук; ФГБУН «Институт молекулярной биологии имени В.А. Энгельгардта» Российской академии наукРоссияSirius University of Science and Technology; Institute of Cytology, Russian Academy of Sciences; Engelhardt Institute of Molecular Biology, Russian Academy of SciencesRussian FederationФГБУН «Институт молекулярной биологии имени В.А. Энгельгардта» Российской академии наукРоссияEngelhardt Institute of Molecular Biology, Russian Academy of SciencesRussian FederationАНОО ВО «Научно-технологический университет “Сириус”»РоссияSirius University of Science and TechnologyRussian FederationАНОО ВО «Научно-технологический университет “Сириус”»; Институт цитологии Российской академии наукРоссияSirius University of Science and Technology; Institute of Cytology, Russian Academy of SciencesRussian FederationАНОО ВО «Научно-технологический университет “Сириус”»; Институт цитологии Российской академии наукРоссияSirius University of Science and Technology; Institute of Cytology, Russian Academy of SciencesRussian Federation202423072024264693700Copyright © Пухальская Т.В., Юракова Т.Р., Михайловская В.С., Богданова Д.А., Демидов О.Н., 20242024Пухальская Т.В., Юракова Т.Р., Михайловская В.С., Богданова Д.А., Демидов О.Н.Pukhalskaia T.V., Yurakova T.R., Mikhailovskaya V.S., Bogdanova D.A., Demidov O.N.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.mimmun.ru/mimmun/article/view/3036

Опухоль-ассоциированные макрофаги (от англ. Tumor-associated macrophages – ТАМs) являются важной и наиболее представленной популяцией иммунных клеток в микроокружении опухоли. В значительной мере именно ТАМs могут определять направленность противоопухолевого иммунного ответа, они могут или дополнительно стимулировать его, или наоборот способствовать формированию иммуносупрессивного микроокружения. Одновременно под влиянием опухолевых клеток и противоопухолевой терапии многие клетки в микроокружении опухоли (от англ. tumor microenvironment, TME) могут развивать состояние сенесцентности. Последнее десятилетие особую популярность приобретает тема старения (сенесцентности, от англ. senescence) и поиска терапии, направленной на удаление сенесцентных клеток. В поисках новых терапевтических стратегий для лечения онкологических заболеваний стареющим клеткам иммунной системы в микроокружении опухоли уделяется особое внимание. Так как наличие сенесцентных ТАМs в опухоли ассоциировано с неблагоприятным прогнозом и плохим ответом на терапию. Учитывая актуальность изучения роли стареющих иммунных клеток в TME (в частности опухоль-ассоциированных макрофагов), мы провели сравнительный анализ экспериментальных протоколов получения опухоль-ассоциированных макрофагов in vitro, чтобы определить наиболее релевантный подход.

Мы проверили два протокола получения макрофагов из костного мозга мыши: 1) путем добавления кондиционной среды от клеточной линии саркомы мыши L929 (LCCM) (LCCM-BMDM); 2) путем добавления рекомбинантного M-CSF мыши (M-CSF-BMDM). Нами было показано, что LCCMBMDM по сравнению с M-CSF-BMDM имеют повышенную экспрессию фермента аргиназы (Arg1), способного подавлять активность противоопухолевых цитотоксических лимфоцитов, путем истощения аргинина в микроокружении опухоли. Также LCCM-BMDM демонстрировали повышенную секрецию факторов, характерных для фенотипа, ассоциированного со старением (от англ. senescenceassociated secretory phenotype, SASP) – IL-6 и TNF. Как Arg1, так и IL-6 c TNF являются маркерами, характерными для сенесцентных макрофагов. Таким образом использование LCCM для получения первичной культуры макрофагов ограничивает дальнейшие шаги в создании модели опухоль-ассоциированных макрофагов, которая отражала бы специфичные характеристики фенотипического ответа макрофагов для различных типов опухолей. Мы считаем, что дифференцировка макрофагов в присутствии M-CSF представляется более предпочтительным протоколом для изучения ТАМs и сенесцентных TAMs с последующим тестированием новых терапевтических стратегий.

Tumor-associated macrophages (TAMs) are an important and most represented population of immune cells in the tumor microenvironment. To a great extent, TAMs can determine the direction of the antitumor immune response; they can either additionally stimulate it or on the contrary contribute to the formation of immunosuppressive microenvironment. At the same time, under the influence of tumor cells and antitumor therapy, many cells in the tumor microenvironment (TME) can develop a state of senescence. Over the last decade, the topic of senescence and the search for therapies aimed at removing senescent cells has gained popularity. In the search for new therapeutic strategies to treat cancer, senescent cells of the immune system in the tumor microenvironment have received special attention since the presence of senescent TAMs in tumors is associated with poor prognosis and poor response to therapy. Given the relevance of studying the role of senescent immune cells in TME (in particular tumor-associated macrophages), we performed a comparative analysis of experimental protocols to obtain tumor-associated macrophages in vitro to determine the most relevant approach. We tested two protocols for obtaining macrophages from mouse bone marrow: (1) by adding conditioned medium from the L929 mouse sarcoma cell line (LCCM) (LCCM-BMDM); and (2) by adding recombinant mouse M-CSF (M-CSF-BMDM). We showed that LCCM-BMDMs, compared to M-CSFBMDMs, have increased expression of the arginase enzyme (Arg1), which can inhibit the activity of anti-tumor cytotoxic lymphocytes by depleting arginine in the tumor microenvironment. LCCM-BMDMs also exhibited increased secretion of factors characteristic of the senescence-associated secretory phenotype (SASP): IL-6 and TNF. Both Arg1 and IL-6 and TNF are markers characteristic of senescence-associated macrophages. Thus, the use of LCCM to obtain primary macrophage culture limits further steps in creating a model of tumor-associated macrophages that reflects the specific characteristics of the macrophage phenotypic response for different tumor types aAnd also limits studies of senescence formation in tumor-associated macrophages in models of carcinogenesis other than sarcoma. We believe that differentiation of macrophages in the presence of M-CSF appears to be a more preferable protocol to study TAMs and senescent TAMs to test new therapeutic strategies.

сенесцентные клеткиp21cip1микроокружение опухолиTAMsSASPin vitrosenescent cellsp21cip1tumor microenvironmentTAMsSASPin vitroРабота выполнена при финансовой поддержке Российского Научного Фонда (грант РНФ 19-75-30032).ReferencesBoutilier A.J., Elsawa S.F. Macrophage polarization states in the tumor microenvironment. Int. J. Mol. Sci., 2021, Vol. 29, no. 22, 6995. doi: 10.3390/ijms22136995.Boutilier A.J., Elsawa S.F. Macrophage polarization states in the tumor microenvironment. Int. J. Mol. Sci., 2021, Vol. 29, no. 22, 6995. doi: 10.3390/ijms22136995.Bruni D., Angell H.K., Galon J. The immune contexture and Immunoscore in cancer prognosis and therapeutic efficacy. Nat. Rev. Cancer, 2020, Vol. 20, no. 11, pp. 662-680.Bruni D., Angell H.K., Galon J. The immune contexture and Immunoscore in cancer prognosis and therapeutic efficacy. Nat. Rev. Cancer, 2020, Vol. 20, no. 11, pp. 662-680.Chambers C.R., Ritchie S., Pereira B.A., Timpson P. Overcoming the senescence-associated secretory phenotype (SASP): a complex mechanism of resistance in the treatment of cancer. Mol. Oncol., 2021, Vol. 15, no. 12, pp. 3242-3255.Chambers C.R., Ritchie S., Pereira B.A., Timpson P. Overcoming the senescence-associated secretory phenotype (SASP): a complex mechanism of resistance in the treatment of cancer. Mol. Oncol., 2021, Vol. 15, no. 12, pp. 3242-3255.de Brito Monteiro L., Davanzo G.G., de Aguiar C.F., Corrêa da Silva F., Andrade J.R., Campos Codo A., Silva Pereira J.A.D., Freitas L.P., Moraes-Vieira P.M. M-CSF- and L929-derived macrophages present distinct metabolic profiles with similar inflammatory outcomes. Immunobiology, 2020, Vol. 225, no. 3, 151935. doi: 10.1016/j.imbio.2020.151935.de Brito Monteiro L., Davanzo G.G., de Aguiar C.F., Corrêa da Silva F., Andrade J.R., Campos Codo A., Silva Pereira J.A.D., Freitas L.P., Moraes-Vieira P.M. M-CSF- and L929-derived macrophages present distinct metabolic profiles with similar inflammatory outcomes. Immunobiology, 2020, Vol. 225, no. 3, 151935. doi: 10.1016/j.imbio.2020.151935.Ding C., Shrestha R., Zhu X., Geller A.E., Wu S., Woeste M.R., Li W., Wang H., Yuan F., Xu R., Chariker J.H., Hu X., Li H., Tieri D., Zhang H.G., Rouchka E.C., Mitchell R., Siskind L.J., Zhang X., Xu X.G., McMasters K.M., Yu Y., Yan J. Inducing trained immunity in pro-metastatic macrophages to control tumor metastasis. Nat. Immunol., 2023, Vol. 24, no. 2, pp. 239-254.Ding C., Shrestha R., Zhu X., Geller A.E., Wu S., Woeste M.R., Li W., Wang H., Yuan F., Xu R., Chariker J.H., Hu X., Li H., Tieri D., Zhang H.G., Rouchka E.C., Mitchell R., Siskind L.J., Zhang X., Xu X.G., McMasters K.M., Yu Y., Yan J. Inducing trained immunity in pro-metastatic macrophages to control tumor metastasis. Nat. Immunol., 2023, Vol. 24, no. 2, pp. 239-254.Haston S., Gonzalez-Gualda E., Morsli S., Ge J., Reen V., Calderwood A., Moutsopoulos I., Panousopoulos L., Deletic P., Carreno G., Guiho R., Manshaei S., Gonzalez-Meljem J. M., Lim H.Y., Simpson D.J., Birch J., Pallikonda H.A., Chandra T., Macias D., Doherty G.J., Rassl D.M., Rintoul R.C., Signore M., Mohorianu I., Akbar A.N., Gil J., Muñoz-Espín D., Martinez-Barbera J.P. Clearance of senescent macrophages ameliorates tumorigenesis in KRAS-driven lung cancer. Cancer Cell, 2023, Vol. 41, no. 7, pp. 1242-1260.e6.Haston S., Gonzalez-Gualda E., Morsli S., Ge J., Reen V., Calderwood A., Moutsopoulos I., Panousopoulos L., Deletic P., Carreno G., Guiho R., Manshaei S., Gonzalez-Meljem J. M., Lim H.Y., Simpson D.J., Birch J., Pallikonda H.A., Chandra T., Macias D., Doherty G.J., Rassl D.M., Rintoul R.C., Signore M., Mohorianu I., Akbar A.N., Gil J., Muñoz-Espín D., Martinez-Barbera J.P. Clearance of senescent macrophages ameliorates tumorigenesis in KRAS-driven lung cancer. Cancer Cell, 2023, Vol. 41, no. 7, pp. 1242-1260.e6.Hu S., Marshall C., Darby J., Wei W., Lyons A.B., Körner H. Absence of tumor necrosis factor supports alternative activation of macrophages in the liver after infection with leishmania major. Front. Immunol., 2018, Vol. 9, 1. doi: 10.3389/fimmu.2018.00001.Hu S., Marshall C., Darby J., Wei W., Lyons A.B., Körner H. Absence of tumor necrosis factor supports alternative activation of macrophages in the liver after infection with leishmania major. Front. Immunol., 2018, Vol. 9, 1. doi: 10.3389/fimmu.2018.00001.Mantovani A., Marchesi F., Malesci A., Laghi L., Allavena P. Tumour-associated macrophages as treatment targets in oncology. Nat. Rev. Clin. Oncol., 2017, Vol. 14, no. 7, pp. 399-416.Mantovani A., Marchesi F., Malesci A., Laghi L., Allavena P. Tumour-associated macrophages as treatment targets in oncology. Nat. Rev. Clin. Oncol., 2017, Vol. 14, no. 7, pp. 399-416.Marim F.M., Silveira T.N., Lima D.S. Jr., Zamboni D.S. A method for generation of bone marrow-derived macrophages from cryopreserved mouse bone marrow cells. PLoS One, 2010, Vol. 5, no. 12, e15263. doi: 10.1371/journal.pone.0015263.Marim F.M., Silveira T.N., Lima D.S. Jr., Zamboni D.S. A method for generation of bone marrow-derived macrophages from cryopreserved mouse bone marrow cells. PLoS One, 2010, Vol. 5, no. 12, e15263. doi: 10.1371/journal.pone.0015263.Schmittgen T.D., Livak K.J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nat. Protoc., 2008, Vol. 3, no. 6, pp. 1101-1108.Schmittgen T.D., Livak K.J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nat. Protoc., 2008, Vol. 3, no. 6, pp. 1101-1108.Yu S., Li Q., Wang Y., Cui Y., Yu Y., Li W., Liu F., Liu T. Tumor-derived LIF promotes chemoresistance via activating tumor-associated macrophages in gastric cancers. Exp. Cell. Res., 2021, Vol. 406, no. 1, 112734. doi: 10.1016/j.yexcr.2021.112734.Yu S., Li Q., Wang Y., Cui Y., Yu Y., Li W., Liu F., Liu T. Tumor-derived LIF promotes chemoresistance via activating tumor-associated macrophages in gastric cancers. Exp. Cell. Res., 2021, Vol. 406, no. 1, 112734. doi: 10.1016/j.yexcr.2021.112734.Yurakova T.R., Gubernatorova E.O., Gorshkova E.A., Nosenko M.A., Nedospasov S.A., Drutskaya M.S. HDM induces distinct immunometabolic phenotype in macrophages in TLR4-dependent manner. Biochim. Biophys. Acta Mol. Basis Dis., 2022, Vol. 1868, no. 12, 166531. doi: 10.1016/j.bbadis.2022.166531.Yurakova T.R., Gubernatorova E.O., Gorshkova E.A., Nosenko M.A., Nedospasov S.A., Drutskaya M.S. HDM induces distinct immunometabolic phenotype in macrophages in TLR4-dependent manner. Biochim. Biophys. Acta Mol. Basis Dis., 2022, Vol. 1868, no. 12, 166531. doi: 10.1016/j.bbadis.2022.166531.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.