mimmunМедицинская иммунологияMedical Immunology (Russia)1563-06252313-741XSPb RAACI10.15789/1563-0625-DRO-2987mimmun-2987Research ArticleКРАТКИЕ СООБЩЕНИЯSHORT COMMUNICATIONSРАЗЛИЧНАЯ РЕАКЦИЯ FCᵧRIIIB (CD16) НЕЙТРОФИЛОВ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА НА МОДЕЛИРОВАНИЕ БАКТЕРИЕМИИ EX VIVO ПАТОГЕННЫМИ И УСЛОВНО-ПАТОГЕННЫМИ МИКРООРГАНИЗМАМИDIFFERENT RESPONSE OF HUMAN BLOOD NEUTROPHIL FCᵧRIIIB (CD16) TO EX VIVO MODELING OF BACTEREMIA BY PATHOGENIC AND OPPORTUNISTIC MICROORGANISMShttps://orcid.org/0000-0002-9016-6578КравцовА. Л.KravtsovA. L.

доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник отдела иммунологии

PhD, MD (Biology), Leading Research, Department Immunology 

rusrapi@microbe.ruКлюеваС. Н.KlyuevaS. N.

кандидат биологических наук, научный сотрудник отдела иммунологии 

PhD (Biology), Research Associate, Department Immunology 

klyueva.cvetlana@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0001-5891-6028ШмельковаТ. П.ShmelkovaT. P.

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник отдела образовательных программ и подготовки специалистов

PhD (Biol.), Senior Researcher, Department of Educational Programs and Specialist Training

rusrapi@microbe.ruhttps://orcid.org/0000-0001-7267-7027КожевниковВ. А.KozhevnikovV. A.

младший научный сотрудник отдела иммунологии 

Junior Researcher, Department of Immunology 

rusrapi@microbe.ruhttps://orcid.org/0000-0001-7548-4845БугорковаС. А.BugorkovaS. A.

доктор медицинских наук, главный научный сотрудник отдела иммунологии 

PhD, MD (Medicine), Chief Researcher

rusrapi@microbe.ruФКУН «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Роспотребнадзора, Саратов, Россия.РоссияFKUN Russian Anti-Plague Institute "Microbe" of Rospotrebnadzor, Saratov, Russian FederationRussian Federation20191710202400Online First2987Copyright © Кравцов А.Л., Клюева С.Н., Шмелькова Т.П., Кожевников В.А., Бугоркова С.А., 20192019Кравцов А.Л., Клюева С.Н., Шмелькова Т.П., Кожевников В.А., Бугоркова С.А.Kravtsov A.L., Klyueva S.N., Shmelkova T.P., Kozhevnikov V.A., Bugorkova S.A.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.mimmun.ru/mimmun/article/view/2987

Наличие FcᵧRIIIb (CD16) на поверхности нейтрофильных гранулоцитов (НГ) крови человека наделяет эти клетки через взаимодействие с IgG ключевым свойством адаптивного иммунитета: антигенспецифическим клеточным ответом. Целью работы явилось сравнение ex vivo реакции  FcᵧRIIIb НГ человека в ответ на добавление в кровь живых клеток условно-патогенных (Escherichia coli,  Staphylococcus aureus) и патогенных (Yersinia pestis, Brucella abortus) видов бактерий. Материалы и методы. Плотность экспрессии  СD16 на НГ определяли методом проточной цитометрии в условных единицах интенсивности флуоресценции (MFI) после окраски лейкоцитов реагентами CD45-FITC и CD16-PE (Backman Coulter, USA) при иммунофенотипировании их в крови согласно Lyse/No-Wash протоколу. Для моделирования бактериемии использовали аттенуированные (вакцинные) штаммы B. abortus 19BA и Y.pestis EV НИИЭГ, а также штаммы S. aureus ATCC 6538 (209-P) и E.coli ATCC 25922. Кровь получали от здоровых доноров (n=10), не прививавшихся от чумы и бруцеллеза. Бактерии 4-х видов добавляли в образцы крови каждого донора в дозе 108 м.к./мл и результаты учитывали по исследуемому показателю через 30 мин,1,2 и 6 ч инкубации. Результаты. Условно-патогенные бактерии, в отличие от Y. pestis и B. abortus, вызывали, начиная с 2 ч инкубации, резкое снижение плотности экспрессии FcᵧRIIIb на НГ крови человека, что являлось маркером развития ex vivo IgG-обусловленной анафилаксии, связанной с присутствием в крови всех здоровых взрослых  людей IgG к специфическим антигенам E. coli и S.aureus. Изменения по маркеру CD16, индуцируемые в НГ условно-патогенными бактериями, предшествовали дегрануляции и лизисy этих клеток в условиях ex vivo, в то время как в присутствии  Y. pestis и B. abortus нейтрофилы в течение 6 ч не подвергались дегрануляции и цитолизу.  Заключение. Полученные в работе экспериментальные данные  отражают известный факт участия в обезвреживании E. coli и S.aureus феномена  внеклеточной антителозависимой цитотоксичности НГ, который реализуется в потоке крови с помощью механизма нетоза и играет решающую роль в предотвращении сепсиса. Отсутствие реакции молекулярного триггера нетоза CD16  на   Y. pestis и B. abortus свидетельствует о том, что в организме человека, не привитого против чумы или бруцеллёза, этот защитный антителозависимый механизм бактерицидности не работает. Оценка реактивности FcᵧRIIIb c использованием проточной цитометрии  на модели бактериемии ex vivo перспективна для  разработки информативного теста оценки специфического иммунитета.

The presence of FcᵧRIIIb (CD16) on the surface of neutrophil granulocytes (NG) in human blood endows these cells, through interaction with IgG, with a key property of adaptive immunity: an antigen-specific cellular  response. The purpose of the work was to compare the ex vivo reaction of human neutrophil FcᵧRIIIb in response to the addition in blood the live cells of  opportunistic (Escherichia coli, Staphylococcus aureus) and pathogenic (Yersinia pestis, Brucella abortus) bacterial species. Materials and methods. The density of CD16 expression on NG was determined by flow cytometry in arbitrary fluorescence intensity units (MFI) after staining leukocytes with CD45-FITC and CD16-PE reagents (Backman Coulter, USA) when immunophenotyping them in the blood according to the Lyse/No-Wash protocol. To model  bacteremia, we used attenuated (vaccine) strains B. abortus 19BA and Y. pestis EV NIIEG, as well as strains S. aureus ATCC 6538 (209-P) and E. coli ATCC 25922. Blood was obtained from healthy donors (n= 10), who were not vaccinated against plague and brucellosis. Bacteria of 4 species were added to the blood samples of each donor in the same dose of 108 mc/ml and the results were taken into account according to the studied indicator after 30 minutes, 1, 2 and 6 hours of incubation. Results. Opportunistic bacteria, in contrast to Y. pestis and B. abortus, caused a sharp decrease in the density of FcᵧRIIIb expression on human blood NG after 2 hours of incubation, which was a marker for the development of ex vivo IgG-mediated anaphylaxis, caused by the presence in the blood of all healthy adults IgG to specific antigens of E. coli and S.aureus. Changes in the CD16 marker induced in NG by opportunistic bacteria preceded degranulation and lysis of these cells under ex vivo conditions, while in the presence of Y. pestis and B. abortus neutrophils did not undergo degranulation and cytolysis within 6 hours. Conclusion. The experimental data obtained in the work reflect the known fact of the participation in the neutralization of E. coli and S. aureus of the phenomenon of extracellular antibody-dependent cytotoxicity of NG, which is realized in the bloodstream using the NETosis mechanism and plays a decisive role in the prevention of sepsis. The absence of a reaction of the molecular trigger CD16 NETosis to Y. pestis and B. abortus indicates that in the human body not vaccinated against plague or brucellosis, this protective antibody-dependent bactericidal mechanism does not work. Evaluation of FcᵧRIIIb reactivity by flow cytometry in an ex vivo bacteremia model is promising from the point of assessing the intensity of post-vaccination immunity in humans. 

Escherichia coliStaphylococcus aureusYersinia pestisBrucella abortusFcᵧRIIIb (CD16)IgG-обусловленная анафилаксиянетозмодель бактериемии ex vivoпроточная цитометрияEscherichia coliStaphylococcus aureusYersinia pestisBrucella abortusFcᵧRIIIb (CD16)IgG-mediated anaphylaxisNETosisex vivo bacteremia modelflow cytometryReferencesКравцов А.Л., Бугоркова С.А., Клюева С.Н., Кожевников В.А., Кудрявцева О.М. Определение экспрессии FcᵧRIIIB (CD16) на поверхности нейтрофилов крови привитых против чумы людей // Молекулярная медицина, 2020. Т.18, № 2. С.33-38. [Kravtsov A.L., Bugorkova S.A., Klyueva C.N., Kozhevnikov V.A., Kudryavtseva O.M. Determination of FcᵧRIIIB (CD16) expression on the surface of blood neutrophils in anti-plague vaccinated people. Molekulyarnaya meditsina = Molecular medicine, 2020, Vol.18, no.2, pp. 33-38. (In Russ.)] doi: 10.29296/24999490-2020-02-06.Кравцов А.Л., Бугоркова С.А., Клюева С.Н., Кожевников В.А., Кудрявцева О.М. Определение экспрессии FcᵧRIIIB (CD16) на поверхности нейтрофилов крови привитых против чумы людей // Молекулярная медицина, 2020. Т.18, № 2. С.33-38. [Kravtsov A.L., Bugorkova S.A., Klyueva C.N., Kozhevnikov V.A., Kudryavtseva O.M. Determination of FcᵧRIIIB (CD16) expression on the surface of blood neutrophils in anti-plague vaccinated people. Molekulyarnaya meditsina = Molecular medicine, 2020, Vol.18, no.2, pp. 33-38. (In Russ.)] doi: 10.29296/24999490-2020-02-06.Кравцов А.Л., Бугоркова С.А., Клюева С.А., Шмелькова Т.П., Кожевников В.А. Оценка изменений фенотипа, интенсивности дегрануляции, гибели и лизиса нейтрофилов при моделировании ex vivo стафилококковой бактериемии. Журнал Микробиологии, Эпидемиологии и Иммунобиологии, 2023. Т.100, №4. С.293-305. [Kravtsov A.L., Bugorkova C.A., Klyueva S.N., Shmelkova T.P., Kozhevnikov V.A. Assessment of changes in the phenotype, intensity of degranulation, death and lysis of neutrophils in ex vivo modeling of Staphylococcal bacteremia. Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii i immunologii = Journal of Microbiology, Epidemiology and Immunobiology, 2023; Vol.100, no.4, pp. 293-305 (in Russ.] doi: https://doi.org/10.36233/0372-9311-384.Кравцов А.Л., Бугоркова С.А., Клюева С.А., Шмелькова Т.П., Кожевников В.А. Оценка изменений фенотипа, интенсивности дегрануляции, гибели и лизиса нейтрофилов при моделировании ex vivo стафилококковой бактериемии. Журнал Микробиологии, Эпидемиологии и Иммунобиологии, 2023. Т.100, №4. С.293-305. [Kravtsov A.L., Bugorkova C.A., Klyueva S.N., Shmelkova T.P., Kozhevnikov V.A. Assessment of changes in the phenotype, intensity of degranulation, death and lysis of neutrophils in ex vivo modeling of Staphylococcal bacteremia. Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii i immunologii = Journal of Microbiology, Epidemiology and Immunobiology, 2023; Vol.100, no.4, pp. 293-305 (in Russ.] doi: https://doi.org/10.36233/0372-9311-384.Нестерова И.В., Колесникова Н.В., Чудилова Г.А., Ломтатидзе Л.В., Ковалева С.В., Евглевский А.А., Нгуен Т.Л. Новый взгляд на нейтрофильные гранулоциты: переосмысление старых догм. Часть 2 // Инфекция и иммунитет, 2018. Т.8, № 1, С.7-18. [Nesterova I.V., Kolesnikova N.V., Chudilova G.A., Lomtatidze L.V., Kovaleva S.V., Evglevsky A.A., Nguyen T.L. The new look at neutrophilic granulocytes: rethinking old dogmas. Part 2. Infektsiya I immunitet = Russian Journal of Infection and Immunity, 2018, Vol.8, no.1, pp.7-18. (In Russ.)] doi: 10.15789/2220-7619-2018-1-7-18.Нестерова И.В., Колесникова Н.В., Чудилова Г.А., Ломтатидзе Л.В., Ковалева С.В., Евглевский А.А., Нгуен Т.Л. Новый взгляд на нейтрофильные гранулоциты: переосмысление старых догм. Часть 2 // Инфекция и иммунитет, 2018. Т.8, № 1, С.7-18. [Nesterova I.V., Kolesnikova N.V., Chudilova G.A., Lomtatidze L.V., Kovaleva S.V., Evglevsky A.A., Nguyen T.L. The new look at neutrophilic granulocytes: rethinking old dogmas. Part 2. Infektsiya I immunitet = Russian Journal of Infection and Immunity, 2018, Vol.8, no.1, pp.7-18. (In Russ.)] doi: 10.15789/2220-7619-2018-1-7-18.Фрадкин В.А. Диагностика аллергии реакциями нейтрофилов крови. М: Медицина, 1985,175с. [Fradkin V.A. Diagnosis of allergies by reactions of blood neutrophils. M: Medicine, 1985, 175 p (in Russ.)].Фрадкин В.А. Диагностика аллергии реакциями нейтрофилов крови. М: Медицина, 1985,175с. [Fradkin V.A. Diagnosis of allergies by reactions of blood neutrophils. M: Medicine, 1985, 175 p (in Russ.)].Barquero-Calvo E., Mora-Cartín R., Arce-Gorvel V., de Diego J.L., Chacón-Díaz C., Chaves-Olarte E., Gazman-Verri C., Buret A.G., Gorvel J-P., Moreno E. Brucella abortus induces the premature death of human neutrophils through the action of its lipopolysaccharide. PLoS Pathog., 2015, Vol.11, no.5, e1004853. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1004853.Barquero-Calvo E., Mora-Cartín R., Arce-Gorvel V., de Diego J.L., Chacón-Díaz C., Chaves-Olarte E., Gazman-Verri C., Buret A.G., Gorvel J-P., Moreno E. Brucella abortus induces the premature death of human neutrophils through the action of its lipopolysaccharide. PLoS Pathog., 2015, Vol.11, no.5, e1004853. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1004853.Granger V., Peyneau M., Chollet-Martin S., de Chaisemartin L. Neutrophil extracellular traps in autoimmunity and allergy: immune complexes at work. Front. Immunology. 2019, 10: 2824. doi: 10.3389/fimmu.2019.02824.Granger V., Peyneau M., Chollet-Martin S., de Chaisemartin L. Neutrophil extracellular traps in autoimmunity and allergy: immune complexes at work. Front. Immunology. 2019, 10: 2824. doi: 10.3389/fimmu.2019.02824.Jönsson F., Mancardi D.A., Kita Y., Karasuyama Y., Iannascoli B., Van Rooijen N., Simizu T., Daeron M., Bruhns P. Mouse and human neutrophils induce anaphylaxis. J. Clin. Invest. 2011, Vol.121, no.4, pp.1484-1496. doi: 10.1172/JCI.145232.Jönsson F., Mancardi D.A., Kita Y., Karasuyama Y., Iannascoli B., Van Rooijen N., Simizu T., Daeron M., Bruhns P. Mouse and human neutrophils induce anaphylaxis. J. Clin. Invest. 2011, Vol.121, no.4, pp.1484-1496. doi: 10.1172/JCI.145232.Khodoun M.V., Strait R., Armstrong L., Yanase N., Frankelman F.D. Identification of markers that distinguish IgE-from IgG-mediated anaphylaxis. Proc. Natl. Acad. Sci., 2011, Vol.108, no.30, pp.12413-12418. doi:10.1073/pnas.1105695108.Khodoun M.V., Strait R., Armstrong L., Yanase N., Frankelman F.D. Identification of markers that distinguish IgE-from IgG-mediated anaphylaxis. Proc. Natl. Acad. Sci., 2011, Vol.108, no.30, pp.12413-12418. doi:10.1073/pnas.1105695108.МсDonald B., Urrutia R., Yipp B.G., Jenne C.N., Kubes P. Intravascular neutrophil extracellular traps capture bacteria from bloodstream during sepsis. Cell Host Microbe, 2012, 12(3):324-333. doi:10.1016/j.chom.2012.06.011.МсDonald B., Urrutia R., Yipp B.G., Jenne C.N., Kubes P. Intravascular neutrophil extracellular traps capture bacteria from bloodstream during sepsis. Cell Host Microbe, 2012, 12(3):324-333. doi:10.1016/j.chom.2012.06.011.Rosales C., Uribe-Querol E. Neutrophil activation by antibody receptors. In book: Neutrophis. Ed. Khajah M. London: Intechopen limited, 2019, 85p. doi: 10.5772/intechopen.80666.Rosales C., Uribe-Querol E. Neutrophil activation by antibody receptors. In book: Neutrophis. Ed. Khajah M. London: Intechopen limited, 2019, 85p. doi: 10.5772/intechopen.80666.Santos L.A., Grisolia J.C., Chavasco J.K., Coelho L.F.L., Malaquias L.C.C. Detection of serum antibodies and peripheral blood mononuclear cells response to Escherichia coli antigens in humans. Brazilian Archives of Biology and Technology. 2021, 64: e21200258. https://doi.org/10.1590/1678-4324-2021200258.Santos L.A., Grisolia J.C., Chavasco J.K., Coelho L.F.L., Malaquias L.C.C. Detection of serum antibodies and peripheral blood mononuclear cells response to Escherichia coli antigens in humans. Brazilian Archives of Biology and Technology. 2021, 64: e21200258. https://doi.org/10.1590/1678-4324-2021200258.Stasulli M.N., Eichelberger K.R., Price P.A., Pechous R.D., Montgomery S.A., Parler J.S., Gildman W.E. Spatially distinct neutrophil responses within the inflammatory lesion of pneumonic plague. mBio, Vol.6, no.5, e01530-15. doi: 10.1128/mBio.01530-15.Stasulli M.N., Eichelberger K.R., Price P.A., Pechous R.D., Montgomery S.A., Parler J.S., Gildman W.E. Spatially distinct neutrophil responses within the inflammatory lesion of pneumonic plague. mBio, Vol.6, no.5, e01530-15. doi: 10.1128/mBio.01530-15.Thomer L., Emolo C., Thammavongsa V., Lim H.K., McAdow M.E., Yu W., Kieffer M., Scheewind O., Missiakas D. Antibodies against a secreted product of Staphylococcus aureus trigger phagocytic killing. J. Exp. Med. 2016, Vol. 213, no.3, pp. 293-301.Thomer L., Emolo C., Thammavongsa V., Lim H.K., McAdow M.E., Yu W., Kieffer M., Scheewind O., Missiakas D. Antibodies against a secreted product of Staphylococcus aureus trigger phagocytic killing. J. Exp. Med. 2016, Vol. 213, no.3, pp. 293-301.Vera E.J., Chew Y.V., Nicholson L., Bruns H., Anderson P., Chen H.T. et al. Standartization of flow cytometry for whole blood immunophenotyping of islet transplant and transplant clinical trial recipients. PLoS One, 2019, Vol. 14, no.5, e0217163. doi: 10.1371/journal pone.0217163.Vera E.J., Chew Y.V., Nicholson L., Bruns H., Anderson P., Chen H.T. et al. Standartization of flow cytometry for whole blood immunophenotyping of islet transplant and transplant clinical trial recipients. PLoS One, 2019, Vol. 14, no.5, e0217163. doi: 10.1371/journal pone.0217163.Wang Y., Jönsson F. Expression, role, and regulation of neutrophil Fcᵧ receptors. Front. Immunology, 2019, 10:1958. doi: 10.3389/fimmu.2019.01958.Wang Y., Jönsson F. Expression, role, and regulation of neutrophil Fcᵧ receptors. Front. Immunology, 2019, 10:1958. doi: 10.3389/fimmu.2019.01958.Won D.I., Kim S., Lee E.H. Neutrophil oxidative burst as a diagnostic indicator of IgG-mediated anaphylaxis. Blood Res., 2018, Vol.53, no.4, pp.299-306. doi: 10.5045/br.2018.53.4.299.Won D.I., Kim S., Lee E.H. Neutrophil oxidative burst as a diagnostic indicator of IgG-mediated anaphylaxis. Blood Res., 2018, Vol.53, no.4, pp.299-306. doi: 10.5045/br.2018.53.4.299.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.