Швыдченко Ирина Николаевна - к.б.н., доцент кафедры физиологии; доцент кафедры нормальной физиологии
350015, г. Краснодар, ул. Буденного, 161
Тел.: 8 (918) 456-74-63
Irina N. Shvydchenko, PhD (Biology), Associate Professor, Department of Physiology; Associate Professor, Department of Normal Physiology
161 Budenny St Krasnodar 350015
Phone: +7 (918) 456-74-63
Быковская Е.Ю. – к.б.н., биолог клинико-диагностической лаборатории
г. Краснодар
Bykovskaya E.Yu., PhD (Biology), Biologist,
Krasnodar
Голубцов В.В. – д.м.н., доцент, профессор кафедры анестезиологии, реаниматологии и трансфузиологии ФПК и ППС
г. Краснодар
Golubtsov V.V., PhD, MD (Medicine), Associate Professor, Professor, Department of Anesthesiology, Reanimatology and Transfusiology, Faculty of Advanced Training and Teaching Staff, Children’s Regional Clinical Hospital
Krasnodar
Несмотря на множество разнообразных методов выделения нейтрофилов из периферической крови, сохраняется актуальной проблема получения достаточного количества жизнеспособной клеточной популяции высокой степени чистоты для количественного определения нейтрофильных цитокинов и экспрессии их мРНК. Рекомендуемые многоэтапные способы очистки нейтрофилов значительно увеличивают по времени продолжительность процесса выделения, могут приводить к активации или апоптозу клеток и сопровождаются их значительными потерями. Наиболее критичным по продолжительности и количеству дополнительных разнообразных манипуляций с клетками является этап предварительной очистки нейтрофилов. В связи с этим актуальным вопросом является сравнение различных методов предварительной изоляции нейтрофилов и выбор наиболее оптимального из них для получения достаточного количества жизнеспособных периферических нейтрофилов, что и явилось целью данной работы. Нами были изучены особенности влияния трех различных протоколов предварительного выделения клеточной взвеси (центрифугирование цельной крови на одинарном градиенте плотности с последующим осаждением эритроцитов декстраном; центрифугирование цельной крови на двойном градиенте плотности; быстрое выделение лейкоцитов с использованием реагента, способствующего агрегации эритроцитов) на количество и жизнеспособность нейтрофилов, очищенных на заключительном этапе с использованием негативной иммуномагнитной селекции. Установлено, что процедура предварительного выделения нейтрофилов для последующей иммуномагнитной изоляции влияет на их количество и жизнеспособность: максимальное количество жизнеспособных нейтрофилов получается при их выделении традиционным методом центрифугирования крови на градиенте плотности с последующим осаждением эритроцитов декстраном. В то же время исследуемые нами три разных метода предварительного выделения нейтрофилов не показали статистически значимых различий по количественному выходу жизнеспособных клеток после иммуномагнитной изоляции, что предполагает использование любого из этих методов в зависимости от возможностей и предпочтений исследователей. В целом наша работа подтверждает данные литературы о том, что многоступенчатый процесс изоляции нейтрофилов позволяет получить клеточную взвесь высокой степени чистоты (> 99,1%), которую можно использовать в дальнейшем для исследования их цитокин-секретирующей активности. Однако такая многоступенчатая изоляция значительно снижает количество нейтрофилов, что может быть критичным при исходно малых объемах крови.
Despite numerous separation methods of neutrophils from peripheral blood, isolation of sufficient quantities of high-purity viable cells for quantitative determination of neutrophil cytokines and their mRNA expression still remains an actual issue. The recommended multi-step purification methods significantly prolong the cell isolation process, potentially leading to cell activation or apoptosis and resulting in significant cell loss. Preliminary purification of neutrophils is the most critical stage in terms of time spent, and several additional manipulations with cells. To address this challenge, our study aimed to compare various methods of preliminary neutrophil isolation in order to select the optimal approach to obtaining a sufficient number of viable peripheral neutrophils.
We studied the effects of three different protocols for preliminary isolation of cell suspensions: (a) centrifugation of whole blood at a single-step density gradient followed by sedimentation of red blood cells with dextran; (b) centrifugation of whole blood on a double density gradient; (c) rapid isolation of leukocytes using a reagent that promotes red blood cell aggregation. The cell counts and viability of purified neutrophils were tested at the final stage using negative immunomagnetic selection. Our study has shown that the methods used for preliminary neutrophil isolation significantly affect both the number and viability of the cells. The highest number of viable neutrophils was obtained using a conventional method of blood centrifugation at a density gradient followed by dextran sedimentation of red blood cells. However, the three studied methods of preliminary neutrophil isolation did not show statistically significant differences with respect to quantitative yield of viable cells after immunomagnetic isolation. These findings suggest that any of these methods may be applied, depending on capabilities and preferences of the researchers. In summary, our findings confirm previous studies indicating that the multistep process of neutrophil isolation allows for obtaining a high-purity cell suspension (> 99.1%) which can be used in future studies of their cytokine-secreting activity. However, such multi-stage isolation significantly reduces the yield of neutrophils, thus being critical for studying of initially small blood volumes.
The authors declare that there are no conflicts of interest present.