mimmunМедицинская иммунологияMedical Immunology (Russia)1563-06252313-741XSPb RAACI10.15789/1563-0625-PTD-2942mimmun-2942Research ArticleОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИORIGINAL ARTICLESРазработка технологии очистки, биохимическая и иммунологическая характеристика рекомбинантного химерного антигена для оценки Т-клеточного иммунитета против коронавирусной инфекцииPurification technology design, biochemical and immunological characteristics of the recombinant chimeric antigen for evaluation of T cell immunity against coronavirus infectionКопатьВ. В.KopatV. V.

Копать В.В. – директор по развитию

Санкт-Петербург

Kopat V.V., Development Director

St. Petersburg

https://orcid.org/0000-0002-9973-0753РябченковаА. А.RiabchenkovaA. A.

Рябченкова А.А. – научный сотрудник

199178, Россия, Санкт-Петербург, Малый пр. В.О., 57, корп. 4, лит. Ж, пом. 5-Н, офис 1.2.5

Тел.: 8 (981) 160-63-15

Riabchenkova A.A., Research Associate

St. Petersburg

riabchenkova@service-gene.ruЧиракЕ. Л.ChirakE. L.

Чирак Е.Л. – научный сотрудник

Санкт-Петербург

Chirak E.L., Research Associate

St. Petersburg

ЧиракЕ. Р.ChirakE. R.

Чирак Е.Р. – научный сотрудник

Санкт-Петербург

Chirak E.R., Research Associate

St. Petersburg

СаенкоА. И.SaenkoA. I.

Саенко А.И. – главный технолог

Санкт-Петербург

Saenko A.I., Chief Process Engineer

St. Petersburg

КудрявцевИ. В.KudryavtsevI. V.

Кудрявцев И.В. – к.б.н., заведующий лабораторией клеточной иммунологии отдела иммунологии; доцент кафедры иммунологии

Санкт-Петербург

Kudryavtsev I.V., PhD (Biology), Head, Laboratory of Cellular Immunology, Department of Immunology; Associate Professor, Department of Immunology

St. Petersburg

ТрулёвА. С.TrulioffA. S.

Трулев А.С. – к.б.н., научный сотрудник отдела иммунологии

Санкт-Петербург

Trulioff A.S., PhD (Biology), Research Associate, Department of Immunology

St. Petersburg

СавинТ. В.SavinT. V.

Савин Т.В. – иммунолог; научный сотрудник кафедры иммунологии

Санкт-Петербург

Savin T.V., Immunologist; Research Associate, Department of Immunology

St. Petersburg

ЗуеваЕ. В.ZuevaE. V.

Зуева Е.В. – к.б.н., старший научный сотрудник

Санкт-Петербург

Zueva E.V., PhD (Biology), Senior Research Associate

St. Petersburg

СимбирцевА. С.SimbirtsevA. S.

Симбирцев А.С. – д.м.н., член-корр. РАН, профессор; профессор кафедры иммунологии

Санкт-Петербург

Simbirtsev A.S., PhD, MD (Medicine), Corresponding Member, Russian Academy of Sciences, Professor; Professor, Department of Immunology

St. Petersburg

ТотолянА. А.TotolyanA. A.

Тотолян Арег А. – д.м.н., профессор, академик РАН, заведующий лабораторией молекулярной иммунологии, директор; заведующий кафедрой иммунологии

Санкт-Петербург

Totolian Areg A., PhD, MD (Medicine), Professor, Full Member, Russian Academy of Sciences, Head, Laboratory of Molecular Immunology, Director; Head, Department of Immunology

St. Petersburg

ДуховлиновИ. В.DukhovlinovI. V.

Духовлинов И.В. – к.б.н., директор по науке

Санкт-Петербург

Dukhovlinov I.V., PhD (Biology), Director of Research

St. Petersburg

ООО «АТГ Сервис Ген»РоссияATG Service Gene LLCRussian FederationФГБНУ «Институт экспериментальной медицины»; ФГБОУ ВО «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова» Министерства здравоохранения РФРоссияInstitute of Experimental Medicine; First St. Petersburg State I. Pavlov Medical UniversityRussian FederationФГБНУ «Институт экспериментальной медицины»РоссияInstitute of Experimental MedicineRussian FederationФБУН «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Пастера»; ФГБОУ ВО «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова» Министерства здравоохранения РФРоссияSaint Petersburg Pasteur Institute; First St. Petersburg State I. Pavlov Medical UniversityRussian FederationФБУН «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Пастера»РоссияSaint Petersburg Pasteur InstituteRussian Federation202405032024263591606Copyright © Копать В.В., Рябченкова А.А., Чирак Е.Л., Чирак Е.Р., Саенко А.И., Кудрявцев И.В., Трулёв А.С., Савин Т.В., Зуева Е.В., Симбирцев А.С., Тотолян А.А., Духовлинов И.В., 20242024Копать В.В., Рябченкова А.А., Чирак Е.Л., Чирак Е.Р., Саенко А.И., Кудрявцев И.В., Трулёв А.С., Савин Т.В., Зуева Е.В., Симбирцев А.С., Тотолян А.А., Духовлинов И.В.Kopat V.V., Riabchenkova A.A., Chirak E.L., Chirak E.R., Saenko A.I., Kudryavtsev I.V., Trulioff A.S., Savin T.V., Zueva E.V., Simbirtsev A.S., Totolyan A.A., Dukhovlinov I.V.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.mimmun.ru/mimmun/article/view/2942

Диагностика специфического Т-клеточного иммунитета к антигенным детерминантам SARS-CoV-2 у пациентов представляется все более важной задачей ввиду накопления данных о роли Т-клеточного иммунного ответа в протекании коронавирусной инфекции и клиренсе SARS-CoV-2 в случае вторичной инфекции. Ранее нами был разработан рекомбинантный антиген CorD_PS для оценки Т-клеточного противовирусного иммунитета, содержащий консервативные и иммуногенные последовательности структурных белков коронавируса SARS-CoV-2. Был получен его штаммпродуцент E. coli CorD_PS со стабильной экспрессией рекомбинантного антигена CorD_PS. Целью настоящей работы является разработка лабораторной технологии получения рекомбинантного антигена CorD_PS, проведение контроля качества полученного химерного белка и изучение его иммунологической активности. Отработку условий культивирования клеток E. coli CorD_PS проводили в конических колбах в среде LB-M_Km при 37 °C, затем масштабировали в ферментере объемом 30 л. Экспрессию индуцировали добавлением ИПТГ. Контроль экспрессии осуществляли в лизатах культур в 12% ПААГ в денатурирующих условиях. Полученную биомассу лизировали с помощью ультразвукового дезинтегратора с последующим центрифугированием. Были подобраны составы лизирующего и солюбилизирующего буферов, а также условия рефолдинга рекомбинантного белка. Для очистки растворенного белка использовали последовательно катионобменную (SP-сефароза), гидрофобную (Butyl-сефароза) и эксклюзионную (Sephacryl S-200 HR) хроматографии. Белковые примеси в препарате определяли методами обращенно-фазовой ВЭЖХ и электрофореза в 12% ПААГ, остаточные липополисахариды определяли с помощью гель-тромб варианта ЛАЛ-теста, остаточные белки штамма-продуцента – методом иммуноферментного анализа, остаточную ДНК штамма-продуцента – методом связывания с красителем PicoGreen. Контроль специфичности осуществляли методом непрямого иммуноферментного анализа. Оценку продукции цитокинов CD4+Т-лимфоцитами в ответ на их стимуляцию рекомбинантным антигеном ex vivo проводили на проточном цитофлуориметре. Выход биомассы при культивировании E. coli CorD_PS в 30 л ферментере составил до 20 г/л за 4 часа индукции 0,1 мМ ИПТГ. Последовательная отмывка телец включения от бактериальных клеточных компонентов и их последующая солюбилизация в буфере, содержащем 8 М мочевину, позволил получить раствор денатурированного антигена с концентрацией 10 мг/мл. Эффективность рефолдинга разведением составила 75%. После трех этапов хроматографической очистки были получены образцы белка с концентрацией 1,2-1,4 мг/мл, чистотой по ВЭЖХ 98,43%, соответствующие ключевым параметрам качества согласно ОФС.1.7.1.0007.15. Рекомбинантный антиген показал специфическое связывание с образцом Первого международного стандарта ВОЗ и образца СОП № 3 анти-SARS-CoV-2 иммуноглобулинов человека в установленном диапазоне концентраций. CD4+Т-лимфоциты эффективно отвечали на обработку рекомбинантным антигеном увеличением продукции IFNγ. Оптимальная концентрация рекомбинантного коронавирусного антигена составила 5 мкг/мл. Разработанный технологический процесс позволяет получать 5-7 грамм антигена коронавирусного рекомбинантного CorD_PS за один цикл культивирования в 30 л ферментационной среды с ключевыми параметрами качества согласно ОФС.1.7.1.0007.15. В результате исследований специфической иммунологической активности рекомбинантного коронавирусного антигена CorD_PS была подтверждена концепция возможности его использования в качестве диагностикума для определения формирования Т-клеточного иммунного ответа.

Diagnosis of specific T cell immunity to the antigenic determinants of SARS-CoV-2 in patients seems to be an increasingly important task due to accumulation of data about the role of T cell immune response in course of coronavirus infection and clearance of SARS-CoV-2 in case of secondary infection. Previously, we designed the recombinant CorD_PS antigen for evaluation of T cell antiviral immunity, containing conservative and immunogenic sequences of structural proteins of the SARS-CoV-2 coronavirus. E. coli CorD_PS producing strain with stable expression of the recombinant CorD_PS antigen was obtained. Aim of the present work is to design a laboratory technology for the production of recombinant antigen CorD_PS, to control the quality of the obtained chimeric protein and to study its immunological activity. Development of the cultivation conditions for E. coli CorD_PS cells was carried out in conical flasks in LB-M_Km medium at 37 °C, then scaled in a fermenter with a volume of 30 liters. Expression was induced by the addition of IPTG. Expression was controlled in culture lysates in 12% SDS-PAGE. The resulting biomass was lysed using an ultrasonic disintegrator with followed by centrifugation. The compositions of lysing and solubilizing buffers were selected, as well as conditions for refolding of the recombinant protein. Cation exchange (SP-sepharose), hydrophobic (Butylsepharose) and exclusive (Sephacryl S-200 HR) chromatography were used sequentially to purify the dissolved protein. Protein impurities in the preparation were determined by reverse-phase HPLC and electrophoresis in 12% SDS-PAGE, residual lipopolysaccharides were determined using a gel-thrombin variant of the LAL test, residual proteins of the producer strain were determined by enzyme immunoassay, residual DNA of the producer strain was determined by binding with PicoGreen dye. Specificity was controlled by indirect enzyme immunoassay. The evaluation of cytokine production by CD4+T lymphocytes in response to their stimulation by recombinant antigen ex vivo was performed on a flow cytofluorimeter. The biomass yield during cultivation of E. coli CorD_PS in a 30L fermenter was up to 20 g/L for 4 hours of 0.1 mM IPTG induction. Sequential washing of inclusion bodies from bacterial cellular components and their subsequent solubilization in a buffer containing 8 M urea allowed to obtain a solution of denatured antigen with a concentration of 10 mg/mL. The efficiency of refolding by dilution was 75%. After three stages of chromatographic purification, protein samples with a concentration of 1.2-1.4 mg/mL, HPLC purity of 98.43%, corresponding to key quality parameters according to the OFS.1.7.1.0007.15, were obtained. The recombinant antigen showed specific binding to a sample of the First WHO International Standard and sample Company Reference Standard No. 3 of anti- SARS-CoV-2 human immunoglobulins in a specified concentration range. CD4+T lymphocytes effectively responded to recombinant antigen treatment by increasing IFNγ production. The optimal concentration of recombinant coronavirus antigen was 5 μg/mL. The developed technological process makes it possible to obtain 5-7 grams of coronavirus recombinant CorD_PS antigen in one cultivation cycle in 30 liters of fermentation medium with key quality parameters according to the OFS.1.7.1.0007.15. As a result of specific immunological activity studies of the recombinant coronavirus antigen CorD_PS, the concept of its possible use as a diagnostic tool for determining the formation of a T cell immune response was confirmed.

SARS-CoV-2COVID-19коронавирусный антиген Cord_PSхроматографияиммуноферментный анализCD4+Т-клеткиCD8+Т-клеткиIFNγТ-клеточный иммунный ответдиагностикумSARS-CoV-2COVID-19coronavirus antigen Cord_PSchromatographyenzyme-linked immunosorbent assayCD4+T cellsCD8+T cellsIFNγT cell immune responsediagnosticumReferencesКопать В.В., Рябченкова А.А., Чирак Е.Л., Чирак Е.Р., Саенко А.И., Колмаков Н.Н., Симбирцев А.С., Духовлинов И.В., Тотолян А.А. Разработка структуры и штамма-продуцента E. coli для антигена, содержащего последовательности белков N, S, M, E коронавируса SARS-CоV-2 // Инфекция и иммунитет, 2023. Т. 13, № 4, C. 653-662.Kopat V.V., Riabchenkova A.A., Chirak E.L., Chirak E.R., Saenko A.I., Kolmakov N.N., Simbirtsev A.S., Dukhovlinov I.V., Totolian A.A. Designing structure and E. coli strain-producer bearing SARS-CoV-2 N, S, M, E protein-related sequence antigen. Infektsiya i immunitet = Russian Journal of Infection and Immunity, 2023, Vol. 13, no. 4, pp. 653-662. (In Russ.) doi: 10.15789/2220-7619-DSA-15624.ОФС. 1.7.1.0007.15. Лекарственные средства, получаемые методами рекомбинантных ДНК. Государственная фармакопея Российской Федерации. XIII изд. 2016. С. 521-541. [OFS. 1.7.1.0007.15. Medicines obtained by recombinant DNA methods. State Pharmacopoeia of the Russian Federation. 13th ed., 2016, pp. 521-541.Bertoletti A., le Bert N., Qui M., Tan A.T. SARS-CoV-2-specific T cells in infection and vaccination. Cell. Mol. Immunol., 2021, Vol. 18, no. 10, pp. 2307-2312.Bertoletti A., le Bert N., Qui M., Tan A.T. SARS-CoV-2-specific T cells in infection and vaccination. Cell. Mol. Immunol., 2021, Vol. 18, no. 10, pp. 2307-2312.Bertoletti A., le Bert N., Tan A.T. SARS-CoV-2-specific T cells in the changing landscape of the COVID-19 pandemic. Immunity, 2022, Vol. 55, no. 10, pp. 1764-1778.Bertoletti A., le Bert N., Tan A.T. SARS-CoV-2-specific T cells in the changing landscape of the COVID-19 pandemic. Immunity, 2022, Vol. 55, no. 10, pp. 1764-1778.Burgess R.R. Refolding solubilized inclusion body proteins. Methods Enzymol., 2009, Vol. 463, pp. 259-282.Burgess R.R. Refolding solubilized inclusion body proteins. Methods Enzymol., 2009, Vol. 463, pp. 259-282.Clark E.D.B. Protein refolding for industrial processes. Curr. Opin. Biotechnol., 2001, Vol. 12, no. 2, pp. 202-207.Clark E.D.B. Protein refolding for industrial processes. Curr. Opin. Biotechnol., 2001, Vol. 12, no. 2, pp. 202-207.Čejka J., Vodrázka Z., Salák J. Carbamylation of globin in electrophoresis and chromatography in the presence of urea. Biochim. Biophys. Acta, 1968, Vol. 154, no. 3, pp. 589-591.Čejka J., Vodrázka Z., Salák J. Carbamylation of globin in electrophoresis and chromatography in the presence of urea. Biochim. Biophys. Acta, 1968, Vol. 154, no. 3, pp. 589-591.Datar R.V., Cartwright T., Rosen C.G. Process economics of animal cell and bacterial fermentations: a case study analysis of tissue plasminogen activator. Biotechnology, 1993, Vol. 11, no. 3, pp. 349-357.Datar R.V., Cartwright T., Rosen C.G. Process economics of animal cell and bacterial fermentations: a case study analysis of tissue plasminogen activator. Biotechnology, 1993, Vol. 11, no. 3, pp. 349-357.Fahnert B., Lilie H., Neubauer P. Inclusion bodies: formation and utilization. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol., 2004, Vol. 89, pp. 93-142.Fahnert B., Lilie H., Neubauer P. Inclusion bodies: formation and utilization. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol., 2004, Vol. 89, pp. 93-142.Fallet B., Foglierini M., Porret R., Alcaraz-Serna A., Sauvage C., Jenelten R., Caplanusi T., Gilliet M., Perez L., Fenwick C., Genolet R., Harari A., Bobisse S., Gottardo R., Pantaleo G., Muller Y.D. Intradermal skin test with mRNA vaccines as a surrogate marker of T cell immunity in immunocompromised patients. J. Infect., 2023, Vol. 87, no. 2, pp. 111-119.Fallet B., Foglierini M., Porret R., Alcaraz-Serna A., Sauvage C., Jenelten R., Caplanusi T., Gilliet M., Perez L., Fenwick C., Genolet R., Harari A., Bobisse S., Gottardo R., Pantaleo G., Muller Y.D. Intradermal skin test with mRNA vaccines as a surrogate marker of T cell immunity in immunocompromised patients. J. Infect., 2023, Vol. 87, no. 2, pp. 111-119.GeurtsvanKessel C.H., Geers D., Schmitz K.S., Mykytyn A.Z., Lamers M.M., Bogers S., Scherbeijn S., Gommers L., Sablerolles R.S.G., Nieuwkoop N.N., Rijsbergen L.C., van Dijk L.L.A., de Wilde J., Alblas K., Breugem T.I., Rijnders B.J.A., de Jager H., Weiskopf D., van der Kuy P.H.M., Sette A., de Vries R.D. Divergent SARSCoV-2 Omicron-reactive T and B cell responses in COVID-19 vaccine recipients. Sci. Immunol., 2022, Vol. 7, no. 69, eabo2202. doi: 10.1126/sciimmunol.abo2202.GeurtsvanKessel C.H., Geers D., Schmitz K.S., Mykytyn A.Z., Lamers M.M., Bogers S., Scherbeijn S., Gommers L., Sablerolles R.S.G., Nieuwkoop N.N., Rijsbergen L.C., van Dijk L.L.A., de Wilde J., Alblas K., Breugem T.I., Rijnders B.J.A., de Jager H., Weiskopf D., van der Kuy P.H.M., Sette A., de Vries R.D. Divergent SARSCoV-2 Omicron-reactive T and B cell responses in COVID-19 vaccine recipients. Sci. Immunol., 2022, Vol. 7, no. 69, eabo2202. doi: 10.1126/sciimmunol.abo2202.Hagel P., Gerding J.J., Fieggen W., Bloemendal H. Cyanate formation in solutions of urea: I. Calculation of cyanate concentrations at different temperature and pH. Biochim. Biophys. Acta, 1971, Vol. 243, no. 3, pp. 366-373.Hagel P., Gerding J.J., Fieggen W., Bloemendal H. Cyanate formation in solutions of urea: I. Calculation of cyanate concentrations at different temperature and pH. Biochim. Biophys. Acta, 1971, Vol. 243, no. 3, pp. 366-373.Hartley D.L., Kane J.F. Properties of inclusion bodies from recombinant Escherichia coli. Biochem. Soc. Trans., 1988, Vol.16, no. 2, pp. 101-102.Hartley D.L., Kane J.F. Properties of inclusion bodies from recombinant Escherichia coli. Biochem. Soc. Trans., 1988, Vol.16, no. 2, pp. 101-102.Kalimuddin S., Tham C.Y.L., Qui M., de Alwis R., Sim J.X.Y., Lim J.M.E., Tan H.C., Syenina A., Zhang S.L., le Bert N., Tan A.T., Leong Y.S., Yee J.X., Ong E.Z., Ooi E.E., Bertoletti A., Low J.G. Early T cell and binding antibody responses are associated with COVID-19 RNA vaccine efficacy onset. Med, 2021, Vol. 2, no. 6, pp. 682-688.Kalimuddin S., Tham C.Y.L., Qui M., de Alwis R., Sim J.X.Y., Lim J.M.E., Tan H.C., Syenina A., Zhang S.L., le Bert N., Tan A.T., Leong Y.S., Yee J.X., Ong E.Z., Ooi E.E., Bertoletti A., Low J.G. Early T cell and binding antibody responses are associated with COVID-19 RNA vaccine efficacy onset. Med, 2021, Vol. 2, no. 6, pp. 682-688.Laslo A.C., Ganea E., Obinger C. Refolding of hexameric porcine leucine aminopeptidase using a cationic detergent and dextrin-10 as artificial chaperones. J. Biotechnol., 2009, Vol. 140, no. 3-4, pp. 162-168.Laslo A.C., Ganea E., Obinger C. Refolding of hexameric porcine leucine aminopeptidase using a cationic detergent and dextrin-10 as artificial chaperones. J. Biotechnol., 2009, Vol. 140, no. 3-4, pp. 162-168.Lin M.F., Williams C., Murray M.V., Conn G., Ropp P.A. Ion chromatographic quantification of cyanate in urea solutions: estimation of the efficiency of cyanate scavengers for use in recombinant protein manufacturing. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci., 2004, Vol. 803, no. 2, pp. 353-362.Lin M.F., Williams C., Murray M.V., Conn G., Ropp P.A. Ion chromatographic quantification of cyanate in urea solutions: estimation of the efficiency of cyanate scavengers for use in recombinant protein manufacturing. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci., 2004, Vol. 803, no. 2, pp. 353-362.Lippincott J., Apostol I. Carbamylation of cysteine: a potential artifact in peptide mapping of hemoglobins in the presence of urea. Analyt. Biochem., 1999, Vol. 267, no. 1, pp. 57-64.Lippincott J., Apostol I. Carbamylation of cysteine: a potential artifact in peptide mapping of hemoglobins in the presence of urea. Analyt. Biochem., 1999, Vol. 267, no. 1, pp. 57-64.Liu L., Wang P., Nair M.S., Yu J., Rapp M., Wang Q., Luo Y., Chan J.F., Sahi V., Figueroa A., Guo X.V., Cerutti G., Bimela J., Gorman J., Zhou T., Chen Z., Yuen K.Y., Kwong P.D., Sodroski J.G., Yin M.T., Ho D.D. Potent neutralizing antibodies against multiple epitopes on SARS-CoV-2 spike. Nature, 2020, Vol. 584, no. 7821, pp. 450-456.Liu L., Wang P., Nair M.S., Yu J., Rapp M., Wang Q., Luo Y., Chan J.F., Sahi V., Figueroa A., Guo X.V., Cerutti G., Bimela J., Gorman J., Zhou T., Chen Z., Yuen K.Y., Kwong P.D., Sodroski J.G., Yin M.T., Ho D.D. Potent neutralizing antibodies against multiple epitopes on SARS-CoV-2 spike. Nature, 2020, Vol. 584, no. 7821, pp. 450-456.Matyushenko V., Isakova-Sivak I., Kudryavtsev I., Goshina A., Chistyakova A., Stepanova E., Prokopenko P., Sychev I., Rudenko L. Detection of IFNγ-secreting CD4+ and CD8+ memory T cells in COVID-19 convalescents after stimulation of peripheral blood mononuclear cells with live SARS-CoV-2. Viruses, 2021, Vol. 13, no. 8, 1490. doi: 10.3390/v13081490.Matyushenko V., Isakova-Sivak I., Kudryavtsev I., Goshina A., Chistyakova A., Stepanova E., Prokopenko P., Sychev I., Rudenko L. Detection of IFNγ-secreting CD4+ and CD8+ memory T cells in COVID-19 convalescents after stimulation of peripheral blood mononuclear cells with live SARS-CoV-2. Viruses, 2021, Vol. 13, no. 8, 1490. doi: 10.3390/v13081490.Mitraki A., Fane B., Haase-Pettingell C., Sturtevant J., King J. Global suppression of protein folding defects and inclusion body formation. Science, 1991, Vol. 253, no. 5015, pp. 54-58.Mitraki A., Fane B., Haase-Pettingell C., Sturtevant J., King J. Global suppression of protein folding defects and inclusion body formation. Science, 1991, Vol. 253, no. 5015, pp. 54-58.Moga E., Lynton-Pons E., Domingo P. The robustness of cellular immunity determines the fate of SARSCoV-2 infection. Front. Immunol., 2022, Vol. 13, 904686. doi: 10.3389/fimmu.2022.904686.Moga E., Lynton-Pons E., Domingo P. The robustness of cellular immunity determines the fate of SARSCoV-2 infection. Front. Immunol., 2022, Vol. 13, 904686. doi: 10.3389/fimmu.2022.904686.Patra A.K., Mukhopadhyay R., Mukhija R., Krishnan A., Garg L.C., Panda A.K. Optimization of inclusion body solubilization and renaturation of recombinant human growth hormone from Escherichia coli. Protein Expr. Purif., 2000, Vol. 18, no. 2, pp. 182-192.Patra A.K., Mukhopadhyay R., Mukhija R., Krishnan A., Garg L.C., Panda A.K. Optimization of inclusion body solubilization and renaturation of recombinant human growth hormone from Escherichia coli. Protein Expr. Purif., 2000, Vol. 18, no. 2, pp. 182-192.Rudolph R., Lilie H. In vitro folding of inclusion body proteins. FASEB J., 1996, Vol. 10, no. 1, pp. 49-56.Rudolph R., Lilie H. In vitro folding of inclusion body proteins. FASEB J., 1996, Vol. 10, no. 1, pp. 49-56.Sekine T., Perez-Potti A., Rivera-Ballesteros O., Strålin K., Gorin J.B., Olsson A., Llewellyn-Lacey S., Kamal H., Bogdanovic G., Muschiol S., Wullimann D.J., Kammann T., Emgård J., Parrot T., Folkesson E., Karolinska COVID-19 Study Group, Rooyackers O., Eriksson L.I., Henter J.I., Sönnerborg A., Buggert M. Robust T cell immunity in convalescent individuals with asymptomatic or mild COVID-19. Cell, 2020, Vol. 183, no. 1, pp. 158-168.Sekine T., Perez-Potti A., Rivera-Ballesteros O., Strålin K., Gorin J.B., Olsson A., Llewellyn-Lacey S., Kamal H., Bogdanovic G., Muschiol S., Wullimann D.J., Kammann T., Emgård J., Parrot T., Folkesson E., Karolinska COVID-19 Study Group, Rooyackers O., Eriksson L.I., Henter J.I., Sönnerborg A., Buggert M. Robust T cell immunity in convalescent individuals with asymptomatic or mild COVID-19. Cell, 2020, Vol. 183, no. 1, pp. 158-168.Singh S.M., Panda A.K. Solubilization and refolding of bacterial inclusion body proteins. J. Biosci. Bioeng., 2005, Vol. 99, no. 4, pp. 303-310.Singh S.M., Panda A.K. Solubilization and refolding of bacterial inclusion body proteins. J. Biosci. Bioeng., 2005, Vol. 99, no. 4, pp. 303-310.Stark G.R. Reactions of cyanate with functional groups of proteins. III. Reactions with amino and carboxyl groups. Biochemistry, 1965, Vol. 4, no. 6, pp. 1030-1036.Stark G.R. Reactions of cyanate with functional groups of proteins. III. Reactions with amino and carboxyl groups. Biochemistry, 1965, Vol. 4, no. 6, pp. 1030-1036.Sun S., Zhou J.Y., Yang W., Zhang H. Inhibition of protein carbamylation in urea solution using ammoniumcontaining buffers. Analyt. Biochem., 2014, Vol. 446, pp. 76-81.Sun S., Zhou J.Y., Yang W., Zhang H. Inhibition of protein carbamylation in urea solution using ammoniumcontaining buffers. Analyt. Biochem., 2014, Vol. 446, pp. 76-81.Volkin D.B., Mach H., Middaugh C.R. Degradative covalent reactions important to protein stability. Mol. Biotechnol., 1997, Vol. 8, pp. 105-122.Volkin D.B., Mach H., Middaugh C.R. Degradative covalent reactions important to protein stability. Mol. Biotechnol., 1997, Vol. 8, pp. 105-122.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.