mimmunМедицинская иммунологияMedical Immunology (Russia)1563-06252313-741XSPb RAACI10.15789/1563-0625-PTF-2905mimmun-2905Research ArticleОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИORIGINAL ARTICLESПсевдонейтрализующий тест для доклинических исследований вакцин против SARS-CoV-2Pseudoneutralizing test for preclinical studies of vaccines against SARS-CoV-2ЧереповичБ. С.CherepovichB. S.

Черепович Б.С. – младший научный сотрудник лаборатории генетики РНК-содержащих вирусов

115088, Россия, Москва, ул. 1-я Дубровская, 15

Тел.: 8 (495) 674-54-97

Cherepovich B.S., Junior Research Associate, Laboratory of Genetics of RNA-containing Viruses

15 1st Dubrovskaya St Moscow 115088 Russian Federation

Phone: +7 (495) 674-54-97

bogdancherepovich@mail.ruКудряшоваА. М.KudryashovaA. M.

Кудряшова А.М. – научный сотрудник лаборатории медицинской биотехнологии

Москва

Kudryashova A.M., Research Associate, Laboratory of Medical Biotechnology

Moscow

КарташоваН. П.KartashovaN. P.

Карташова Н.П. – научный сотрудник лаборатории экспериментальной вирусологии

Москва

Kartashova N.P., Research Associate, Laboratory of Experimental Virology

Moscow

ГрачеваА. В.GrachevaA. V.

Грачева А.В. – научный сотрудник лаборатории молекулярной вирусологии

Москва

Gracheva A.V., Research Associate, Laboratory of Molecular Virology

Moscow

МануйловВ. А.ManuilovV. A.

Мануйлов В.А. – к.б.н., старший научный сотрудник лаборатории трансляционной медицины

Москва

Manuilov V.A., PhD (Biology), Senior Research Associate, Laboratory of Translational Medicine

Moscow

ЛеневаИ. А.LenevaI. A.

Ленева И.А. – д.б.н., заведующая лабораторией экспериментальной вирусологии

Москва

Leneva I.A., PhD, MD (Biology), Head, Laboratory of Experimental Virology

Moscow

БорисоваО. В.BorisovaO. V.

Борисова О.В. – к.х.н., заведующая лабораторией медицинской биотехнологии

Москва

Borisova O.V., PhD (Сhemistry), Head, Laboratory of Medical Biotechnology

Moscow

olvb@yandex.ruСвитичО. А.SvitichO. A.

Свитич О.А. – д.м.н., член-корр. РАН, заведующая лабораторией молекулярной иммунологии

Москва

Svitich O.A., PhD, MD (Medicine), Corresponding Member, Russian Academy of Sciences, Head, Laboratory of Molecular Immunology

Moscow

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток имени И.И. Мечникова»РоссияI. Mechnikov Research Institute of Vaccines and SeraRussian FederationФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения РФРоссияN. Gamaleya Research Center of Epidemiology and MicrobiologyRussian Federation202422112023263569576Copyright © Черепович Б.С., Кудряшова А.М., Карташова Н.П., Грачева А.В., Мануйлов В.А., Ленева И.А., Борисова О.В., Свитич О.А., 20242024Черепович Б.С., Кудряшова А.М., Карташова Н.П., Грачева А.В., Мануйлов В.А., Ленева И.А., Борисова О.В., Свитич О.А.Cherepovich B.S., Kudryashova A.M., Kartashova N.P., Gracheva A.V., Manuilov V.A., Leneva I.A., Borisova O.V., Svitich O.A.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.mimmun.ru/mimmun/article/view/2905

Цель данного исследования – оценка эффективности конкурентного иммуноферментного метода, определяющего антитела, специфически связывающие рецептор-связывающий домен субъединицы S1 шиповидного белка коронавируса SARS-CoV-2 и блокирующие образование инициаторного инфицирующего комплекса между RBD и ангиотензин-превращающим ферментом 2 (псевдонейтрализующий тест, ПНТ) на стадии доклинических исследований вакцины против SARS-CoV-2. Исследовали 37 сывороток крови животных (8 коров, 10 собак, 19 трансгенных мышей линии B6.Cg-Tg(K18-ACE2)2Prlmn/HEMI Hemizygous for Tg(K18-ACE2)2Prlmn, самки и самцы (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, США)), иммунизированных кандидатными вакцинными препаратами против COVID-19, содержащими белок Spike SARS-CoV-2. В данном исследовании использовали 3 метода определения антител к вирусу SARS-CoV-2, а именно: 1) псевдонейтрализующий тест (ПНТ) для выявление антител, блокирующих взаимодействие RBD и АСE-2; 2) реакцию нейтрализации (РН) для выявления вируснейтрализующих антител и 3) твердофазный иммуноферментный анализ для определения антител класса G к RBD SARS-CoV-2. Результаты выражались, соответственно, в виде коэффициента подавления (КП), титра вируснейтрализующих антител (ВНА) и индекса позитивности (ИП). Полученные данные показывают выраженную, статистически значимую корреляцию между результатами, полученными иммуноферментными методами с титрами ВНА, определенными в вирусологической РН в исследуемых группах животных. Так, коэффициент Спирмена, определенный для корреляции между титрами ВНА и КП, составил, соответственно, 0,9151; 0,8085 и 0,9207 для собак, трансгенных мышей и коров. Коэффициент Спирмена для титров ВНА и ИП составил 0,8854 и 0,8955 для собак и трансгенных мышей. Таким образом, для целей оценки иммуногенности вакцинных препаратов в настоящем исследовании, адекватными и безопасными аналогами РН являются оба метода – ИФА для определения IgG к RBD и ПНТ для определения антител, блокирующих образование комплекса между RBD и ACE-2. Однако преимуществом ПНТ является его универсальность, исключающая необходимость использования различных конъюгатов для выявления антител в сыворотках крови разных видов животных. Данные, полученные нами для образцов трех видов животных (трансгенных мышей, собак и коров), хорошо соотносятся с аналогичными, полученными нами и другими исследователями для сывороток крови людей и демонстрирующими высокую корреляцию между результатами ПНТ-подобных конкурентных тестов для определения антител, блокирующих образование комплекса RBD и ACE-2, с результатами определения ВНА в вирусологической РН. Следовательно, предлагаемый в настоящей работе ПНТ может найти применение при проведении доклинических и клинических испытаний кандидатных вакцинных и лекарственных препаратов.

The purpose of this study was to evaluate efficiency of a competitive enzyme immunoassay which specifically detects antibodies that recognize the receptor-binding domain at the S1 subunit of SARS-CoV-2 coronavirus spike protein and block the formation of initiator infection complex between RBD and angiotensinconverting enzyme 2 (pseudo-neutralizing test, PNT) being applied at the stage of preclinical studies of anti- SARS-CoV-2 vaccine. We studied 37 animal blood sera (8 cows, 10 dogs) as well as 19 male and female transgenic mice of the B6.Cg-Tg(K18-ACE2)2Prlmn/HEMI line hemizygous for Tg(K18-ACE2)2Prlmn (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA, USA)) immunized with candidate COVID-19 vaccine preparations containing SARS-CoV-2 Spike protein. In this study, 3 techniques were used for detection of antibodies to SARS-CoV-2 virus, as follows: 1) a pseudo-neutralizing test (PNT) to detect antibodies that block interaction between RBD and ACE-2; 2) neutralization test (RN) to detect virus-neutralizing antibodies, and 3) enzyme-linked immunosorbent assay to detect class G antibodies to RBD SARS-CoV-2. The results were expressed, respectively, as the suppression quotients (SC), titers of virus-neutralizing antibodies (VNA), and the positivity index (IP). The data obtained show a pronounced, statistically significant correlation between the results obtained by immunoassay methods with VNA titers determined in the studied animals by the virological neutralization test. E.g., the Spearman correlation quotients for VNA and SC titers, were, respectively, 0.9151; 0.8085, and 0.9207 for dogs, transgenic mice and cows. The Spearman quotient for VNA and PI titers was 0.8854 and 0.8955 for dogs and transgenic mice. Thus, in order to evaluate immunogenicity of vaccine preparations in our study, both methods are adequate and safe analogues to RN-ELISA for determination of IgG to RBD and PNT aoming for detection of antibodies blocking the formation of RBD/ACE-2 complex. However, the advantage of PNT is its versatility, eliminating the need to use different conjugates to detect antibodies in blood sera of different animal species. The data obtained for samples of three animal species (transgenic mice, dogs and cows) well agree with similar data obtained by us and other researchers for human blood sera, thus demonstrating high correlation between the results of PNT-like competitive tests to determine antibodies that block the formation of the RBD/ACE-2 complex, with VNA results in virologic neurtralization test (RN). Therefore, the proposed PNT technique may be used in preclinical and clinical trials of candidate vaccines and drugs.

COVID-19SARS-CoV-2твердофазный ИФАвируснейтрализующие антителапсевдонейтрализующий тестсыворотки крови животныхCOVID-19SARS-CoV-2solid-phase ELISAvirus-neutralizing antibodiespseudo-neutralizing testblood serumanimalsReferencesAdams O., Andrée M., Hermsen D., Lübke N., Timm J., Schaal H., Müller L. Comparison of commercial SARS-CoV-2 surrogate neutralization assays with a full virus endpoint dilution neutralization test in two different cohorts. J. Virol. Methods, 2022, Vol. 307, 114569. doi: 10.1016/j.jviromet.2022.114569.Adams O., Andrée M., Hermsen D., Lübke N., Timm J., Schaal H., Müller L. Comparison of commercial SARS-CoV-2 surrogate neutralization assays with a full virus endpoint dilution neutralization test in two different cohorts. J. Virol. Methods, 2022, Vol. 307, 114569. doi: 10.1016/j.jviromet.2022.114569.Amanat F., White K.M., Miorin L., Strohmeier S., McMahon M., Meade P., Liu W.C., Albrecht R.A., Simon V., Martinez-Sobrido L., Moran T., García-Sastre A., Krammer F. An in vitro microneutralization assay for SARSCoV-2 serology and drug screening. Curr. Protoc. Microbiol., 2020, Vol. 58, no. 1, e108. doi: 10.1002/cpmc.108.Amanat F., White K.M., Miorin L., Strohmeier S., McMahon M., Meade P., Liu W.C., Albrecht R.A., Simon V., Martinez-Sobrido L., Moran T., García-Sastre A., Krammer F. An in vitro microneutralization assay for SARSCoV-2 serology and drug screening. Curr. Protoc. Microbiol., 2020, Vol. 58, no. 1, e108. doi: 10.1002/cpmc.108.Benner S.E., Patel E.U., Laeyendecker O., Pekosz A., Littlefield K., Eby Y., Fernandez R.E., Miller J., Kirby C.S., Keruly M., Klock E., Baker O.R., Schmidt H.A., Shrestha R., Burgess I., Bonny T.S., Clarke W., Caturegli P., Sullivan D., Shoham S., Quinn T.C., Bloch E.M., Casadevall A., Tobian A.A.R., Redd A.D. SARS-CoV-2 antibody avidity responses in COVID-19 patients and convalescent plasma donors. J. Infect. Dis, 2020, Vol. 222, pp. 1974-1984.Benner S.E., Patel E.U., Laeyendecker O., Pekosz A., Littlefield K., Eby Y., Fernandez R.E., Miller J., Kirby C.S., Keruly M., Klock E., Baker O.R., Schmidt H.A., Shrestha R., Burgess I., Bonny T.S., Clarke W., Caturegli P., Sullivan D., Shoham S., Quinn T.C., Bloch E.M., Casadevall A., Tobian A.A.R., Redd A.D. SARS-CoV-2 antibody avidity responses in COVID-19 patients and convalescent plasma donors. J. Infect. Dis, 2020, Vol. 222, pp. 1974-1984.Gushchin V.A., Dolzhikova I.V., Shchetinin A.M., Odintsova A.S., Siniavin A.E., Nikiforova M.A., Pochtovyi A.A., Shidlovskaya E.V., Kuznetsova N.A., Burgasova O.A., Kolobukhina L.V., Iliukhina A.A., Kovyrshina A.V., Botikov A.G., Kuzina A.V., Grousova D.M., Tukhvatulin A.I., Shcheblyakov D.V., Zubkova O.V., Karpova O.V., Voronina O.L., Ryzhova N.N., Aksenova E.I., Kunda M.S., Lioznov D.A., Danilenko D.M., Komissarov A.B., Tkachuck A.P., Logunov D.Y., Gintsburg A.L. Neutralizing activity of sera from Sputnik Vvaccinated people against variants of concern (VOC: B.1.1.7, B.1.351, P.1, B.1.617.2, B.1.617.3) and Moscow Endemic SARS-CoV-2 Variants. Vaccines (Basel), 2021, Vol. 9, no. 7, 779. doi: 10.3390/vaccines9070779.Gushchin V.A., Dolzhikova I.V., Shchetinin A.M., Odintsova A.S., Siniavin A.E., Nikiforova M.A., Pochtovyi A.A., Shidlovskaya E.V., Kuznetsova N.A., Burgasova O.A., Kolobukhina L.V., Iliukhina A.A., Kovyrshina A.V., Botikov A.G., Kuzina A.V., Grousova D.M., Tukhvatulin A.I., Shcheblyakov D.V., Zubkova O.V., Karpova O.V., Voronina O.L., Ryzhova N.N., Aksenova E.I., Kunda M.S., Lioznov D.A., Danilenko D.M., Komissarov A.B., Tkachuck A.P., Logunov D.Y., Gintsburg A.L. Neutralizing activity of sera from Sputnik Vvaccinated people against variants of concern (VOC: B.1.1.7, B.1.351, P.1, B.1.617.2, B.1.617.3) and Moscow Endemic SARS-CoV-2 Variants. Vaccines (Basel), 2021, Vol. 9, no. 7, 779. doi: 10.3390/vaccines9070779.Kolesov D.E., Sinegubova M.V., Dayanova L.K., Dolzhikova I.V., Vorobiev I.I., Orlova N.A. Fast and accurate surrogate virus neutralization test based on antibody-mediated blocking of the interaction of ACE2 and SARSCoV-2 spike protein RBD. Diagnostics (Basel), 2022, Vol. 12, no. 2, 393. doi: 10.3390/diagnostics12020393.Kolesov D.E., Sinegubova M.V., Dayanova L.K., Dolzhikova I.V., Vorobiev I.I., Orlova N.A. Fast and accurate surrogate virus neutralization test based on antibody-mediated blocking of the interaction of ACE2 and SARSCoV-2 spike protein RBD. Diagnostics (Basel), 2022, Vol. 12, no. 2, 393. doi: 10.3390/diagnostics12020393.Logunov D.Y., Dolzhikova I.V., Shcheblyakov D.V., Tukhvatulin A.I., Zubkova O.V., Dzharullaeva A.S., Kovyrshina A.V., Lubenets N.L., Grousova D.M., Erokhova A.S., Botikov A.G., Izhaeva F.M., Popova O., Ozharovskaya T.A., Esmagambetov I.B., Favorskaya I.A., Zrelkin D.I., Voronina D.V., Shcherbinin D.N., Semikhin A.S., Simakova Y.V., Tokarskaya E.A., Egorova D.A., Shmarov M.M., Nikitenko N.A., Gushchin V.A., Smolyarchuk E.A., Zyryanov S.K., Borisevich S.V., Naroditsky B.S., Gintsburg A.L.; Gam-COVID-Vac Vaccine Trial Group. Safety and efficacy of an rAd26 and rAd5 vector-based heterologous prime-boost COVID-19 vaccine: an interim analysis of a randomised controlled phase 3 trial in Russia. Lancet, 2021, Vol. 397, no. 10275, pp. 671-681.Logunov D.Y., Dolzhikova I.V., Shcheblyakov D.V., Tukhvatulin A.I., Zubkova O.V., Dzharullaeva A.S., Kovyrshina A.V., Lubenets N.L., Grousova D.M., Erokhova A.S., Botikov A.G., Izhaeva F.M., Popova O., Ozharovskaya T.A., Esmagambetov I.B., Favorskaya I.A., Zrelkin D.I., Voronina D.V., Shcherbinin D.N., Semikhin A.S., Simakova Y.V., Tokarskaya E.A., Egorova D.A., Shmarov M.M., Nikitenko N.A., Gushchin V.A., Smolyarchuk E.A., Zyryanov S.K., Borisevich S.V., Naroditsky B.S., Gintsburg A.L.; Gam-COVID-Vac Vaccine Trial Group. Safety and efficacy of an rAd26 and rAd5 vector-based heterologous prime-boost COVID-19 vaccine: an interim analysis of a randomised controlled phase 3 trial in Russia. Lancet, 2021, Vol. 397, no. 10275, pp. 671-681.Manuylov V., Dolzhikova I., Kudryashova A., Cherepovich B., Kovyrshina A., Iliukhina A., Kharchenko O., Semashko M., Tkachuk A., Gushchin V., Borisova O. Simple ELISA methods to estimate neutralizing antibody Titers to SARS-CoV-2: IgG quantification, the avidity index, and the surrogate virus neutralization test. Arch. Microbiol. Immunol., 2022, Vol. 6, pp. 213-220.Manuylov V., Dolzhikova I., Kudryashova A., Cherepovich B., Kovyrshina A., Iliukhina A., Kharchenko O., Semashko M., Tkachuk A., Gushchin V., Borisova O. Simple ELISA methods to estimate neutralizing antibody Titers to SARS-CoV-2: IgG quantification, the avidity index, and the surrogate virus neutralization test. Arch. Microbiol. Immunol., 2022, Vol. 6, pp. 213-220.Taylor S.C., Hurst B., Martiszus I., Hausman M.S., Sarwat S., Schapiro J.M., Rowell S., Lituev A. Semiquantitative, high throughput analysis of SARS-CoV-2 neutralizing antibodies: Measuring the level and duration of immune response antibodies post infection/vaccination. Vaccine, 2021, Vol. 39, no. 39, pp. 5688-5698.Taylor S.C., Hurst B., Martiszus I., Hausman M.S., Sarwat S., Schapiro J.M., Rowell S., Lituev A. Semiquantitative, high throughput analysis of SARS-CoV-2 neutralizing antibodies: Measuring the level and duration of immune response antibodies post infection/vaccination. Vaccine, 2021, Vol. 39, no. 39, pp. 5688-5698.Wajnberg A., Amanat F., Firpo A., Altman D.R., Bailey M.J., Mansour M., McMahon M., Meade P., Mendu D.R., Muellers K., Stadlbauer D., Stone K., Strohmeier S., Simon V., Aberg J., Reich D.L., Krammer F., Cordon-Cardo C. Robust neutralizing antibodies to SARS-CoV-2 infection persist for months. Science, 2020, Vol. 370, no. 6521, pp. 1227-1230.Wajnberg A., Amanat F., Firpo A., Altman D.R., Bailey M.J., Mansour M., McMahon M., Meade P., Mendu D.R., Muellers K., Stadlbauer D., Stone K., Strohmeier S., Simon V., Aberg J., Reich D.L., Krammer F., Cordon-Cardo C. Robust neutralizing antibodies to SARS-CoV-2 infection persist for months. Science, 2020, Vol. 370, no. 6521, pp. 1227-1230.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.