mimmunМедицинская иммунологияMedical Immunology (Russia)1563-06252313-741XSPb RAACI10.15789/1563-0625-CAO-2895mimmun-2895Research ArticleИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫIMMUNOLOGICAL METHODSСравнительный анализ наборов реагентов для выделения ДНК из сухих пятен кровиComparative analysis of reagent kits for DNA extraction from dry blood stainsСедыхА. В.SedykhA. V.

Седых Анна Васильевна – младший научный сотрудник лаборатории молекулярной иммунологии.

197101, Санкт-Петербург, ул. Мира, 14

Тел.: 8 (812) 233-20-92

Anna V. Sedykh - Junior Research Associate, Laboratory of Molecular Immunology, St. Petersburg Pasteur Institute.

14 Mira St St. Petersburg 197101

Phone: +7 (812) 233-20-92

ann_sedykh@mail.ruСайтгалинаМ. А.SaitgalinaM. A.

Сайтгалина Мария Александровна – младший научный сотрудник лаборатории молекулярной иммунологии.

Санкт-Петербург

Maria A. Saitgalina - Junior Research Associate, Laboratory  of Molecular Immunology, St. Petersburg Pasteur Institute.

St. Petersburg

sajgalinam@mail.ruОстанковаЮ. В.OstankovaYu. V.

Останкова Юлия Владимировна – кандидат биологических наук, заведующая лабораторией иммунологии и вирусологии ВИЧ-инфекции, старший научный сотрудник лаборатории молекулярной иммунологии.

Санкт-Петербург

Yulia V. Ostankova - PhD (Biology), Head, Laboratory of Immunology and Virology HIV, Senior Research Associate, Laboratory of Molecular Immunology St. Petersburg Pasteur Institute.

St. Petersburg

shenna1@yandex.ruТотолянА. А.TotolianA. A.

Тотолян Арег Артемович – доктор медицинских наук, профессор, академик РАН, заведующий лабораторией молекулярной иммунологии, директор ФБУН «Санкт-Петербургский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера»; заведующий кафедрой иммунологии ФГБОУ ВО «ПСПбГМУ им. ак. И.П. Павлова» МЗ РФ.

Санкт-Петербург

Areg A. Totolian - PhD, MD (Medicine), Professor, Full Member, Russian Academy of Sciences, Head, Laboratory of Molecular Immunology, Director, Saint Petersburg Pasteur Institute; Head, Department of Immunology, First St. Petersburg State I. Pavlov Medical University.

St. Petersburg

totolian@pasteurorg.ruФБУН «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Пастера»РоссияSaint Petersburg Pasteur InstituteRussian FederationФБУН «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Пастера»; ФГБОУ ВО «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова» Министерства здравоохранения РФРоссияSaint Petersburg Pasteur Institute; First St. Petersburg State I. Pavlov Medical UniversityRussian Federation20233010202325614531462Copyright © Седых А.В., Сайтгалина М.А., Останкова Ю.В., Тотолян А.А., 20232023Седых А.В., Сайтгалина М.А., Останкова Ю.В., Тотолян А.А.Sedykh A.V., Saitgalina M.A., Ostankova Y.V., Totolian A.A.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.mimmun.ru/mimmun/article/view/2895

Неонатальный скрининг – обязательная процедура обследования новорожденных, которая позволяет выявить наличие генетических заболеваний. Для массового обследования детей используют сухие пятна крови. Эта технология является наиболее доступной и удобной для транспортировки и хранения биологического материала. Выделение ДНК – один из важных этапов в молекулярной диагностике, точность которого особенно важна при генетическом анализе. Различные наборы для экстракции ДНК предлагают различные протоколы и реагенты, которые могут отличаться по эффективности и качеству выделения.

Целью нашей работы было проведение сравнительного анализа наборов реагентов для экстракции ДНК из сухих пятен крови.

Материалом служили образцы сухой капли крови на картах Гатри, полученные от здоровых доношенных младенцев на 3-4 день жизни в рамках программы скрининга новорожденных.

Методы исследования включали спектрофотометрический анализ для определения концентрации и чистоты ДНК, оценивали также простоту протоколов, продолжительность выделения, возможность автоматизации процесса. Контроль эффективности экстракции ДНК разными наборами реагентов дополнительно осуществляли по результатам ПЦР в режиме реального времени с применением тест-системы для оценки уровней TREC и KREC в периферической крови, так как количественный анализ требует большей внимательности к исследуемому материалу.

При оценке чистоты НК, экстрагированных с использованием всех четырех анализируемых наборов, можно было наблюдать успешную депротеинизацию образцов ДНК и относительную чистоту. Средняя чистота ДНК для набора «Экстра-ДНК-Био»  составила  2,2±0,23,  для  «ЭКСТРА-преп PS» – 1,89±0,23, для «МагноПрайм ЮНИ» при ручном и автоматическом выделении – 2,31±0,21 и 2,85±0,09 соответственно. Средняя концентрация ДНК для набора «Экстра-ДНК-Био» составила 15,28 мкг/мл, для «ЭКСТРА-преп PS» – 16,26 мкг/мл, для «МагноПрайм ЮНИ» при ручном и автоматическом выделении – 62,5 мкг/мл и 102,28 мкг/мл, соответственно. Согласно примененному критерию Краскела–Уоллиса и тесту Данна, значимые различия и по параметру TREC, и по параметру KREC присутствуют между группой образцов ДНК, экстрагированных с использованием набора реагентов «МагноПрайм ЮНИ» при ручном выделении, с группами образцов, экстрагированных другими способами («МагноПрайм ЮНИ» при автоматическом выделении) или наборами «Экстра-ДНК-Био» и «ЭКСТРА-преп PS».

В ходе настоящего исследования четыре сравниваемых набора реагентов продемонстрировали высокий уровень сходимости полученных данных, удовлетворяя всем необходимым параметрам для проведения дальнейшего молекулярно-генетического анализа, могут быть использованы для неонатального скрининга и в других областях исследований, требующих экстракции ДНК из сухой капли крови.

Neonatal screening is a mandatory newborn screening procedure that detects the presence of genetic diseases. Dry blood stains are used for mass screening of children. This technology is the most affordable and convenient for the transportation and storage of biological material. DNA extraction is one   of the important steps in molecular diagnostics, the accuracy of which is particularly important in genetic analysis. Different DNA extraction kits offer different protocols and reagents, which may vary in efficiency and quality of extraction.

The aim of our work was to perform a comparative analysis of reagent kits for DNA extraction from dried blood spots.

The materials were dried blood drop samples on Guthrie cards obtained from healthy preterm infants on day 3-4 of life as part of a newborn screening program.

The study methods included spectrophotometric analysis to determine the concentration and purity of DNA, the simplicity of protocols, the duration of isolation, and the possibility of automating the process were also evaluated. The efficiency of DNA isolation using different reagent kits was additionally monitored by real-time PCR results using a test system to assess the level of TREC and KREC in peripheral blood, since quantitative analysis requires more attention to the material under study.

In assessing the purity of the nucleic acid extracted using four kits analyzed, successful deproteinization of DNA samples and relative purity could be observed. The average DNA purity for the “Extra-DNA-Bio” set was 2.2±0.23, for “EXTRA-prep PS” – 1.89±0.23, for “MagnoPrime UNI” with manual and automatic isolation – 2.31±0.21 and 2.85±0.09, respectively. The average DNA concentration for the Extra-DNA-Bio kit was 15.28 μg/mL, for the EXTRA-Prep PS kit it was 16.26 μg/mL, and for the MagnoPrime UNI for manual and automated isolation it was 62.5 μg/mL and 102.28 μg/mL, respectively. According to the applied Kraskell-Wallis criterion and Dunn’s test, significant differences in both TREC and KREC parameters are present between the group of DNA samples extracted using the “MagnoPrime UNI” reagent kit for manual extraction and the groups of samples extracted by other methods (“MagnoPrime UNI” for automatic extraction) or “Extra-DNA-Bio” and “EXTRA-Prep PS” kits.

In the course of the present study, four comparable reagent sets demonstrated a high level of convergence of the obtained data, satisfying all the necessary parameters for further molecular genetic analysis, can be used for neonatal screening and in other areas of research requiring DNA extraction from a dried blood spots.

неонатальный скринингсухие пятна кровивыделение ДНКпервичные иммунодефицитыTRECKRECneonatal screeningdried blood spotsDNA isolationprimary immunodeficienciesTRECKRECReferencesАукенов Н.Е., Масабаева М.Р., Хасанова У.У. Выделение и очистка нуклеиновых кислот. Состояние проблемы на современном этапе // Наука и здравоохранение, 2014. № 1. С. 51-53.Aukenov N.E., Masabaeva M.R., Hasanova U.U. Isolation and purification of nucleic acids. State of the problem at the present stage. Nauka i zdravoohranenie = Science and Healthcare, 2014, no. 1, pp. 51-53. (In Russ.)Воронин С.В., Куцев С.И. Неонатальный скрининг на наследственные заболевания в России: вчера, сегодня, завтра // Неонатология: Новости. Мнения. Обучение, 2022. Т. 10, № 4. С. 34-39.Voronin S.V., Kutsev S.I. Neonatal screening for hereditary diseases in Russia: yesterday, today, and tomorrow. Neontalogia: Novosti. Mneniya. Obuchenie = Neonatology: News, Opinions, Training, 2022, Vol. 10, no. 4, pp. 34-39. (In Russ.)Габдуллина Д.М., Усенова О.П., Моренко М.А., Ковзель Е.Ф. Первичные иммунодефициты: современные подходы в диагностике и терапии // Клиническая медицина Казахстана, 2016. № 1. С. 12-15.Gabdullina D.M., Ussenova O.P., Morenka M.A., Kovzel E.F. Primary immunodeficiency: modern approaches to diagnosis and therapy. Clinicheskaya meditsina Kazakhstana = Clinical Medicine of Kazakhstan, 2016, no. 1, pp. 12-15. (In Russ.)Григорьев К.И., Харитонова Л.А., Радзинский В.Е., Папышева О.В., Котайш Г.А. Перинатальная медицина и проблемы неонатального скрининга // Медицинская сестра, 2017. № 4. С. 3-9.Grigoryev K.I., Kharitonova L.A., Radzinsky V.E., Papysheva O.V., Kotaish G.A. Perinatal medicine and problems of newborn screening. Meditsinskaya sestra = Nurse, 2017, no. 4, pp. 3-9. (In Russ.)Дерябина С.С., Тузанкина И.А., Власова Е.В., Болков М.А., Шершнёв В.Н. Неонатальный скрининг на тяжелую комбинированную иммунную недостаточность в России: прекрасное далеко или завтрашняя реальность? // Вопросы современной педиатрии, 2017. Т. 16, № 1. С. 59-66.Deryabina S.S., Tuzankina I.A., Vlasova E.V., Bolkov M.A., Shershnev V.N. Neonatal screening for severe combined immune deficiency in Russia: Glorious future or tomorrow’s reality? Voprosy sovremennoy pediatrii = Issues of Modern Pediatrics, 2017, Vol. 16, no. 1, pp. 59-66. (In Russ.)Долудин Ю.В., Лимонова А.С., Козлова В.А., Ефимова И.А., Борисова А.Л., Мешков А.Н., Покровская М.С., Драпкина О.М. Сбор и хранение ДНК-содержащего биоматериала и выделенной ДНК // Кардиоваскулярная терапия и профилактика, 2020. Т. 19, № 6. С. 196-204.Doludin Yu.V., Limonova A.S., Kozlova V.A., Efimova A.I., Borisova A.L., Meshkov A.N., Pokrovskaya M.S., Drapkina O.M. Collection and storage of DNA-containing biomaterial and isolated DNA. Kardiovasculyarnaya terapia i profilaktika = Cardiovascular Therapy and Prevention, 2020, Vol. 19, no. 6, pp. 196-204. (In Russ.)Карева М.А., Орлова Е.М. Адреногенитальный синдром: прошлое, настоящее и будущее // Проблемы эндокринологии, 2011. Т. 57, №. 1. С. 66-70.Kareva M.A., Orlova E.M. Adrenogenital syndrome: past, present, and future. Problemy endokrinologii = Problems of Endocrinology, 2011, Vol. 57, no. 1, pp. 66-70. (In Russ.)Лепесова М.М., Ушакова Т.С., Мырзалива Б.Д. Дифференциальная диагностика спинальной мышечной амиотрофии первого типа // Наука о жизни и здоровье, 2016. № 1. С. 38-46.Lepessova M.M., Ushakova T.S., Myrzaliyeva B.D. Differential diagnosis of the spinal muscular amyotrophy type one. Nauka o zhizni i zdorovie = Life and Health Science, 2016, no. 1, pp. 38-46. (In Russ.)Никифорова А.И., Абрамов Д.Д., Зобкова Г.Ю., Горяинова А.В., Семыкин С.Ю., Шубина Е., Донников А.Е., Трофимов Д.Ю. Определение мутаций гена CFTR у детей с муковисцидозом // Вестник Российского государственного медицинского университета, 2018. № 3. С. 35-41.Nikiforova A.I., Abramov D.D., Zobkova G.Y., Goriainova A.V., Semykin S.Y., Shubina J., Donnikov A.E., Trofimov D.Y. Detection of CFTR mutations in children with cystic fibrosis. Vestnik Rossiiskogo gosudarstvennogo meditsinskogo universiteta = Bulletin of Russian State Medical University, 2018, no. 3, pp. 35-41. (In Russ.)Образцов И.В., Фёдорова Л.А., Продеус А.П., Кудлай Д.А., Корсунский И.А. Референсные значения концентрации TREC и KREC у детей и подростков в возрасте 1-17 лет // Педиатрия им. Г. Н. Сперанского, 2021. Т.100, № 6. С. 38-45.Obraztsov L.A. Fedorova A.P. Prodeus D.A. Kudlay I.A. Korsunsky. Reference values for the concentration of TREC and KREC in children aged 1-17 years. Pediatria. Zhurnal im. G.N. Speransky = Pediatry. Journal n. a. G.N. Speransky, 2021, Vol. 100, no. 6, pp. 38-45. (In Russ.)Петеркова В.А., Безлепкина О.Б., Ширяева Т.Ю., Вадина Т.А., Нагаева Е.В., Чикулаева О.А., Шредер Е.В., Конюхова М.Б., Макрецкая Н.А., Шестопалова Е.А., Митькина В.Б. Клинические рекомендации «Врожденный гипотиреоз» // Проблемы эндокринологии, 2022. Т. 68, № 2. С. 90-103.Peterkova V.A., Bezlepkina O.B., Shiryaeva T.U., Vadina T.A., Nagaeva E.V., Chikulaeva O.A., Shreder E.V., Konuhova M.B., Makretskaya N.A., Shestopalova E.A., Mitkina V.B. Clinical guideline of “Congenital hypothyroidism”. Problemi endokrinologii = Problems of Endocrinology, 2022, Vol. 68, no. 2, pp. 90-103. (In Russ.)Ребриков Д.В., Трофимов Д.Ю. ПЦР «В реальном времени»: подходы к анализу данных (обзор) // Прикладная биохимия и микробиология, 2006. Т. 42, № 5. С. 520-528.Rebrikov D.V., Trofimov D.Yu. Real-time PCR: a review of approaches to data analysis. Prikladnaya biokhimiya i microbiologia = Applied Biochemistry and Microbiology, 2006, Vol. 42, no. 5, pp. 520-528. (In Russ.)Сайтгалина М.А., Останкова Ю.В., Любимова Н.Е., Семенов А.В., Кузнецова Р.Н., Тотолян А.А. Модифицированный метод количественного определения уровней TREC и KREC в периферической крови у больных с иммунодефицитными состояниями // Инфекция и иммунитет, 2022. Т. 12, № 5. С. 981-996. doi: 10.15789/2220-7619-MMF-2039.Saitgalina M.A., Ostankova Y.V., Liubimova N.E., Semenov A.V., Kuznetsova R.N., Totolian A.A. Modified quantitative approach for assessing peripheral blood TREC and KREC levels in immunodeficient patients. Infektsiya i immunitet = Russian Journal of Infection and Immunity, 2022, Vol. 12, no. 5, pp. 981-996. (In Russ.) doi: 10.15789/2220-7619-MMF-2039.Anderson S. GALT deficiency galactosemia. MCN Am. J. Matern. Child Nurs., 2018, Vol. 43, no. 1, pp. 44-51.Anderson S. GALT deficiency galactosemia. MCN Am. J. Matern. Child Nurs., 2018, Vol. 43, no. 1, pp. 44-51.Choi E.H., Lee S.K., Ihm C., Sohn Y.H. Rapid DNA extraction from dried blood spots on filter paper: potential applications in biobanking. Osong Public Health and Res. Perspect., 2014, Vol. 5, no. 6, pp. 351-357.Choi E.H., Lee S.K., Ihm C., Sohn Y.H. Rapid DNA extraction from dried blood spots on filter paper: potential applications in biobanking. Osong Public Health and Res. Perspect., 2014, Vol. 5, no. 6, pp. 351-357.Lucena-Aguilar G., Sanchez-Lopez A.M., Barberan-Aceituno C., Carrillo-Ávila J.A., Lopez-Guerrero J.A., Aguilar-Quesada R. DNA Source Selection for Downstream Applications Based on DNA Quality Indicators Analysis. Biopreserv. Biobank., 2016, Vol. 14, no. 4, pp. 264-270.Lucena-Aguilar G., Sanchez-Lopez A.M., Barberan-Aceituno C., Carrillo-Ávila J.A., Lopez-Guerrero J.A., Aguilar-Quesada R. DNA Source Selection for Downstream Applications Based on DNA Quality Indicators Analysis. Biopreserv. Biobank., 2016, Vol. 14, no. 4, pp. 264-270.Mas S., Crescenti A., Gasso P., Vidal-Taboada J.M., Lafuente A. DNA cards: determinants of DNA yield and quality in collecting genetic samples for pharmacogenetic studies. Basic Clin. Pharmacol. Toxicol., 2007, Vol. 101, no. 2, pp. 132-137.Mas S., Crescenti A., Gasso P., Vidal-Taboada J.M., Lafuente A. DNA cards: determinants of DNA yield and quality in collecting genetic samples for pharmacogenetic studies. Basic Clin. Pharmacol. Toxicol., 2007, Vol. 101, no. 2, pp. 132-137.Nikiforova A.I., Abramov D.D., Kadochnikova V.V., Zobkova G.U., Ogurtsova K.A., Brjuhanova N.O., Shestopalova E.A., Kochetkova T.O., Shubina E.S., Donnikov A.E., Trofimov D.Y. Determining the frequency of PAH mutations in Moscow region residents with phenylketonuria using a combination of real-time PCR and next-generation sequencing. Bulletin of Russian State Medical University, 2017, no. 4, pp. 38-44.Nikiforova A.I., Abramov D.D., Kadochnikova V.V., Zobkova G.U., Ogurtsova K.A., Brjuhanova N.O., Shestopalova E.A., Kochetkova T.O., Shubina E.S., Donnikov A.E., Trofimov D.Y. Determining the frequency of PAH mutations in Moscow region residents with phenylketonuria using a combination of real-time PCR and next-generation sequencing. Bulletin of Russian State Medical University, 2017, no. 4, pp. 38-44.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.