mimmunМедицинская иммунологияMedical Immunology (Russia)1563-06252313-741XSPb RAACI10.15789/1563-0625-HNC-2837mimmun-2837Research ArticleКРАТКИЕ СООБЩЕНИЯSHORT COMMUNICATIONSNK-клетки человека интернализуют рекомбинантный основной стресс-индуцируемый белок HSP70Human NK cells internalize recombinant major stress protein HSP70https://orcid.org/0000-0001-5278-9937ШевченкоМ. А.ShevchenkoM. A.

Шевченко Мария Александровна – кандидат биологических наук, научный сотрудник

Москва

Marina A. Shevchenko, PhD (Biology), Research Associate

Moscow

mshevch@gmail.comГарбузД. Г.GarbuzD. G.

Гарбуз Давид Григорьевич – доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник

Москва

David G. Garbuz, PhD, MD (Biology), Leading Research Associate

Moscow

dgarbuz@yandex.ruДавлетшинА. И.DavletshinA. I.

Давлетшин Артем Игоревич – младший научный сотрудник

Москва

Artem I. Davletshin, Junior Research Associate

Moscow

artem.dav7@yandex.ruБойкоА. А.BoykoA. A.

Бойко Анна Александровна – кандидат биологических наук, научный сотрудник

117997, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10

Anna A. Boyko, PhD (Biology), Research Associate

16/10 Miklukho-Maklay St Moscow 117997

 

boyko_anna@mail.ruЕвгеньевМ. Б.Evgen'evM. B.

Евгеньев Михаил Борисович – доктор биологических наук, профессор, главный научный сотрудник

Москва

Michael B. Evgen’ev, PhD, MD (Biology), Professor, Chief Research Associate

Moscow

misha672011@yahoo.comСапожниковА. М.SapozhnikovA. M.

Сапожников Александр Михайлович – доктор биологических наук, профессор, главный научный сотрудник

Москва

Aleksandr M. Sapozhnikov, PhD, MD (Biology), Professor, Chief Research Associate

Moscow

amsap@mail.ruФГБУН «Институт биоорганической химии имени академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова» Российской академии наукРоссияShemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry of the Russian Academy of SciencesRussian FederationФГБУН «Институт молекулярной биологии имени В.А. Энгельгардта» Российской академии наукРоссияEngelhardt Institute of Molecular Biology, Russian Academy of SciencesRussian Federation202301062023253447452Copyright © Шевченко М.А., Гарбуз Д.Г., Давлетшин А.И., Бойко А.А., Евгеньев М.Б., Сапожников А.М., 20232023Шевченко М.А., Гарбуз Д.Г., Давлетшин А.И., Бойко А.А., Евгеньев М.Б., Сапожников А.М.Shevchenko M.A., Garbuz D.G., Davletshin A.I., Boyko A.A., Evgen'ev M.B., Sapozhnikov A.M.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.mimmun.ru/mimmun/article/view/2837

Одной из основных функций белков теплового шока семейства 70 кДа (HSP70) является защита внутриклеточных протеинов от повреждающих воздействий стрессирующих факторов различной природы. Наряду с этим HSP7070 играют важную роль в жизнедеятельности клеток и в нормальных физиологических условиях, выполняя вспомогательные, так называемые шаперонные функции. Эти упомянутые функции реализуются во внутриклеточном пространстве; однако в некоторых случаях эти белки также обнаруживаются на клеточной поверхности и во внеклеточной среде. Причины и механизмы такой транслокации на клеточную поверхность и секреции HSP70 во внеклеточное пространство еще недостаточно изучены. Вместе с тем показано, что такая необычная внеклеточная локализация HSP70 активирует клетки иммунной системы. Поверхностные HSP70 и их внеклеточный пул стимулируют цитотоксическую активность, в том числе NK-клеток. Однако прямых экспериментальных доказательств возможности интернализации белков HSP70 NK-клетками еще не было продемонстрировано. В данной работе представлены результаты взаимодействия внеклеточного пула HSP70 с NK-клетками периферической крови здоровых доноров. Результаты исследования подтвердили возможность интернализации экзогенных молекул HSP70 NK-клетками. С этой целью нами были получены флуоресцентно меченые молекулы рекомбинантного стресс-индуцируемого HSP70 человека. О связывании HSP70 с флуорохромом свидетельствовала флуоресценция полученного конъюгата при воздействии освещения с длиной волны 488 нм. Данные электрофореза свидетельствовали об отсутствии деградации белка в процессе мечения, чистоте и стабильности модифицированного белка. Для оценки взаимодействия HSP70 с NK-клетками флуоресцентно меченый HSP70 добавляли к культуре NK-клеток in vitro, выделенных методом магнитной сепарации из мононуклеарной фракции периферической крови, и анализировали с помощью конфокальной микроскопии. Этот анализ показал, что живые NK-клетки интернализуют внеклеточные HSP70, которые локализуются как в лизосомах, так и в фагосомах. Наши эксперименты впервые иллюстрируют процесс проникновения внеклеточных HSP70 в эти клетки. Полученные результаты позволяют предположить, что активация NK-клеток под действием экзогенного HSP70 может быть связана в том числе и с интернализацией этих белков.

 

Heat shock proteins 70 kDa (HSP70) protect intracellular proteins from the damaging effects of stress factors of various natures. Moreover, HSP70 play an important role in the vital activity of cells under normal physiological conditions, performing chaperone functions. These functions are realized in the intracellular space; however, in some cases, these proteins are also found on the cell surface and in the extracellular environment. The causes and mechanisms of HSP70 translocation to the cell surface and secretion into the extracellular space have not yet been well understood, but such an unusual localization of HSP70 activates the immune system. The surface HSP70 and their extracellular pool stimulate the cytotoxic activity of NK cells. However, direct experimental evidence for the internalization of HSP70 molecules by NK cells has not yet been demonstrated. This paper presents the results of the interaction of the extracellular HSP70 pool with NK cells from the peripheral blood. The results demonstrated the confirmation of the internalization of exogenous HSP70 molecules by NK cells. To this end, fluorescently labeled recombinant stress-inducible human HSP70 were obtained. The electrophoretic data indicated the absence of protein degradation during the labeling process, the purity and stability of the modified protein. To assess the interaction of HSP70 with NK cells, the fluorescently labeled HSP70 was added to an in vitro culture of NK cells isolated by magnetic separation from the peripheral blood mononuclear fraction and analyzed by confocal microscopy. This analysis indicated that living NK cells internalize extracellular HSP70 with localization both in lysosomes and in phagosomes. Our experiments illustrated for the first time the process of penetration of the extracellular form of HSP70 into these cells. The results suggest that the activation of NK cells under the action of exogenous HSP70 could be associated with the internalization of these protein molecules.

HSP70 – белок теплового шока 70 кДаNK-клеткиинтернализацияфлуоресцентное мечениефлуоресцентная визуализацияконфокальная микроскопияHSP70 – heat shock protein 70 kDaNK cellsinternalizationfluorescent labelingfluorescent imaginglaser confocal microscopyThe study was funded by Russian Science Foundation, grant numbers 23-15-00472 and 19-14-00167.The study was funded by Russian Science Foundation, grant numbers 23-15-00472 and 19-14-00167.ReferencesArispe N., Doh M., Simakova O., Kurganov B., de Maio A. Hsc70 and HSP70 interact with phosphatidylserine on the surface of PC12 cells resulting in a decrease of viability. FASEB J., 2004, Vol. 18, no. 14, pp. 1636-1345.Arispe N., Doh M., Simakova O., Kurganov B., de Maio A. Hsc70 and HSP70 interact with phosphatidylserine on the surface of PC12 cells resulting in a decrease of viability. FASEB J., 2004, Vol. 18, no. 14, pp. 1636-1345.Evgen’ev M., Bobkova N., Krasnov G., Garbuz D., Funikov S., Kudryavtseva A., Kulikov A., Samokhin A., Maltsev A., Nesterova I. The Effect of Human HSP70 Administration on a Mouse Model of Alzheimer’s Disease Strongly Depends on Transgenicity and Age. J. Alzheimers Dis., 2019, Vol. 67, no. 4, pp.1391-1404.Evgen’ev M., Bobkova N., Krasnov G., Garbuz D., Funikov S., Kudryavtseva A., Kulikov A., Samokhin A., Maltsev A., Nesterova I. The Effect of Human HSP70 Administration on a Mouse Model of Alzheimer’s Disease Strongly Depends on Transgenicity and Age. J. Alzheimers Dis., 2019, Vol. 67, no. 4, pp.1391-1404.Gurskiy Y.G., Garbuz D.G., Soshnikova N.V., Krasnov A.N., Deikin A., Lazarev V.F., Sverchinskyi D., Margulis B.A., Zatsepina O.G., Karpov V.L., Belzhelarskaya S.N., Feoktistova E., Georgieva S.G., Evgen’ev M.B. The development of modified human HSP70 (HSPA1A) and its production in the milk of transgenic mice. Cell Stress Chaperones, 2016, Vol. 21, no. 6, pp. 1055-1064.Gurskiy Y.G., Garbuz D.G., Soshnikova N.V., Krasnov A.N., Deikin A., Lazarev V.F., Sverchinskyi D., Margulis B.A., Zatsepina O.G., Karpov V.L., Belzhelarskaya S.N., Feoktistova E., Georgieva S.G., Evgen’ev M.B. The development of modified human HSP70 (HSPA1A) and its production in the milk of transgenic mice. Cell Stress Chaperones, 2016, Vol. 21, no. 6, pp. 1055-1064.Guzhova I., Kislyakova K., Moskaliova O., Fridlanskaya I., Tytell M., Cheetham M., Margulis B. In vitro studies show that HSP70 can be released by glia and that exogenous HSP70 can enhance neuronal stress tolerance. Brain Res,. 2001, Vol. 914, no. 1-2, pp. 66-73.Guzhova I., Kislyakova K., Moskaliova O., Fridlanskaya I., Tytell M., Cheetham M., Margulis B. In vitro studies show that HSP70 can be released by glia and that exogenous HSP70 can enhance neuronal stress tolerance. Brain Res,. 2001, Vol. 914, no. 1-2, pp. 66-73.Guzhova I.V., Arnholdt A.C., Darieva Z.A., Kinev A.V., Lasunskaia E.B., Nilsson K., Bozhkov V.M., Voronin A.P., Margulis B.A. Effects of exogenous stress protein 70 on the functional properties of human promonocytes through binding to cell surface and internalization. Cell Stress Chaperones, 1998, Vol. 3, no. 1, pp. 67-77.Guzhova I.V., Arnholdt A.C., Darieva Z.A., Kinev A.V., Lasunskaia E.B., Nilsson K., Bozhkov V.M., Voronin A.P., Margulis B.A. Effects of exogenous stress protein 70 on the functional properties of human promonocytes through binding to cell surface and internalization. Cell Stress Chaperones, 1998, Vol. 3, no. 1, pp. 67-77.Hunter-Lavin C., Davies E.L., Bacelar M.M., Marshall M.J., Andrew S.M., Williams J.H. HSP70 release from peripheral blood mononuclear cells. Biochem. Biophys. Res. Commun., 2004, Vol. 324, no. 2, pp. 511-517.Hunter-Lavin C., Davies E.L., Bacelar M.M., Marshall M.J., Andrew S.M., Williams J.H. HSP70 release from peripheral blood mononuclear cells. Biochem. Biophys. Res. Commun., 2004, Vol. 324, no. 2, pp. 511-517.Johnson J.D., Fleshner M. Releasing signals, secretory pathways, and immune function of endogenous extracellular heat shock protein 72. J. Leukoc. Biol, 2006, Vol. 79, pp. 425-434.Johnson J.D., Fleshner M. Releasing signals, secretory pathways, and immune function of endogenous extracellular heat shock protein 72. J. Leukoc. Biol, 2006, Vol. 79, pp. 425-434.Moseley P.L. Heat shock proteins and the inflammatory response. Ann. N. Y. Acad. Sci., 1998, Vol. 856, pp. 206-213.Moseley P.L. Heat shock proteins and the inflammatory response. Ann. N. Y. Acad. Sci., 1998, Vol. 856, pp. 206-213.Multhoff G. Activation of natural killer cells by heat shock protein 70. Int. J. Hyperthermia, 2002, Vol. 18, no. 6, pp. 576-585.Multhoff G. Activation of natural killer cells by heat shock protein 70. Int. J. Hyperthermia, 2002, Vol. 18, no. 6, pp. 576-585.Njemini R., Bautmans I., Onyema O.O., van Puyvelde K., Demanet C., Mets T. Circulating Heat Shock protein 70 in health, aging and disease. BMC Immunol., 2011, Vol. 12, 24. doi: 10.1186/1471-2172-12-24.Njemini R., Bautmans I., Onyema O.O., van Puyvelde K., Demanet C., Mets T. Circulating Heat Shock protein 70 in health, aging and disease. BMC Immunol., 2011, Vol. 12, 24. doi: 10.1186/1471-2172-12-24.Pockley A.G. Heat shock proteins in health and disease: therapeutic targets or therapeutic agents? Exp. Rev. Mol. Med., 2001, Vol. 21, pp. 1-21.Pockley A.G. Heat shock proteins in health and disease: therapeutic targets or therapeutic agents? Exp. Rev. Mol. Med., 2001, Vol. 21, pp. 1-21.Shevtsov M., Pitkin E., Ischenko A., Stangl S., Khachatryan W., Galibin O., Edmond S., Lobinger D., Multhoff G. Ex vivo HSP70-Activated NK Cells in Combination With PD-1 Inhibition Significantly Increase Overall Survival in Preclinical Models of Glioblastoma and Lung Cancer. Front. Immunol., 2019, Vol. 10, 454. doi: 10.3389/fimmu.2019.00454.Shevtsov M., Pitkin E., Ischenko A., Stangl S., Khachatryan W., Galibin O., Edmond S., Lobinger D., Multhoff G. Ex vivo HSP70-Activated NK Cells in Combination With PD-1 Inhibition Significantly Increase Overall Survival in Preclinical Models of Glioblastoma and Lung Cancer. Front. Immunol., 2019, Vol. 10, 454. doi: 10.3389/fimmu.2019.00454.Srivastava P. Roles of heat-shock proteins in innate and adaptive immunity. Nat. Rev. Immunol., 2002, Vol. 2, no. 3, pp. 185-194.Srivastava P. Roles of heat-shock proteins in innate and adaptive immunity. Nat. Rev. Immunol., 2002, Vol. 2, no. 3, pp. 185-194.Tsan M.F., Gao B. Cytokine function of heat shock proteins. Am. J. Physiol. Cell Physiol., 2004, Vol. 286, no. 4, pp. C739-C744.Tsan M.F., Gao B. Cytokine function of heat shock proteins. Am. J. Physiol. Cell Physiol., 2004, Vol. 286, no. 4, pp. C739-C744.Yurinskaya M., Zatsepina O.G., Vinokurov M.G., Bobkova N.V., Garbuz D.G., Morozov A.V., Kulikova D.A., Mitkevich V.A., Makarov A.A., Funikov S.Yu., Evgen’ev M.B. The fate of exogenous human HSP70 introduced into animal cells by different means. Curr. Drug Deliv., 2015, Vol. 12, no. 5, pp. 524-532.Yurinskaya M., Zatsepina O.G., Vinokurov M.G., Bobkova N.V., Garbuz D.G., Morozov A.V., Kulikova D.A., Mitkevich V.A., Makarov A.A., Funikov S.Yu., Evgen’ev M.B. The fate of exogenous human HSP70 introduced into animal cells by different means. Curr. Drug Deliv., 2015, Vol. 12, no. 5, pp. 524-532.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.