mimmunМедицинская иммунологияMedical Immunology (Russia)1563-06252313-741XSPb RAACI10.15789/1563-0625-IVE-2481mimmun-2481Research ArticleОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИORIGINAL ARTICLESОпыт культивирования NK-клеток человека с фидерными клетками in vitroIn vitro experience of human natural killer cell culture with feeder cellshttps://orcid.org/0000-0001-8673-3616ГельмЮ. В.GelmYu. V.

Юлия Витальевна Гельм – научный сотрудник отделения клинической иммунологии.

249036, Калужская область, Обнинск, ул. Королева, 4. Тел.: 8 (48439) 2-96-04

Gelm Yu.V., Research Associate, Department of Clinical Immunology.

249036, Kaluga Region, Obninsk,  Korolev str., 4. Phone: 7 (48439) 2-96-04

julia_marizina@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0003-2579-0558ПасоваИ. А.PasovaI. A.

Ирина Алексеевна Пасова – врач аллерголог-иммунолог отделения клинической иммунологии.

Обнинск, Калужская обл.

Clinical Allergologist, Department of Clinical Immunology, A. Tsyb Medical Radiological Research Center.

Obninsk, Kaluga Region

savelueva@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0001-9103-9688ГривцоваЛ. Ю.GrivtsovaL. Yu.

 

Людмила Юрьевна Гривцова – Доктор биологических наук, заведующая отделением клинической иммунологии.

Обнинск, Калужская обл.

PhD, MD (Biology), Head, Department  of Clinical Immunology, A. Tsyb Medical Radiological Research Center.

Obninsk, Kaluga Region

grivtsova@mail.ruКонстантиноваТ. В.KonstantinovaT. V.

Татьяна Викторовна Константинова – научный сотрудник отделения клинической иммунологии.

Обнинск, Калужская обл.

Research Associate, Department of Clinical Immunology, A. Tsyb Medical Radiological Research Center.

Obninsk, Kaluga Region

galinachugaeva@mail.ruМихайловскийН. В.MikhaylovskyN. V.

Николай Васильевич Михайловский – научный сотрудник отдела по разработке и исследованиям в области иммунологии.

Москва

Research Associate, Department for Development and Research in Immunology.

Moscow

nickmikh.mrrc@gmail.comРыбачукВ. А.RybachukV. A.

Виктория Александровна Рыбачук – лаборант-исследователь отдела по разработке и исследованиям в области иммунологии ООО «Текон Медицинские приборы»; студент магистратуры биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова

Москва

Research Laboratory Assistant, Department for Development and Research in Immunology, Tekon Medical Devices LLC; Master’s Student, Faculty of Biology, Lomonosov SU.

Moscow

rybachuk2016@list.ruhttps://orcid.org/0000-0002-3881-3221АбакушинаЕ. В.AbakushinaE. V.

 

Елена Вячеславовна Абакушина – доктор медицинских наук, заместитель генерального директора, руководитель отдела по разработке и исследованиям в области иммунологии.

Москва

PhD, MD (Medicine), Deputy General Director, Head, Department for Development and Research in Immunology.

Moscow

abakushina@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0001-7689-6032ИвановС. А.IvanovS. A.

Сергей Анатольевич Иванов – доктор медицинских наук, профессор РАН, директор МОНЦ имени А.Ф. Цыба – филиала ФГБУ НИРЦР; профессор кафедры онкологии и рентгенорадиологии имени В.П. Харченко медицинского института РУДН.

Обнинск, Калужская обл; Москва

PhD, MD (Medicine), Professor, Russian Academy of Sciences, Director, A. Tsyb Medical Radiological Research Center, Affiliation NMRCR; Professor, Department of Oncology and Rentenology/Radiology, Medical Institute, RUP’s Friendship.

Obninsk, Kaluga Region; Moscow

oncourolog@gmail.comhttps://orcid.org/0000-0001-8784-8415КапринА. Д.KaprinA. D.

Андрей Дмитриевич Каприн – доктор медицинских наук, профессор, академик РАН, генеральный директор ФГБУ НИРЦР; заведующий кафедрой онкологии и рентгенорадиологии имени В.П. Харченко медицинского института РУДН.

Обнинск, Калужская обл; Москва

PhD, MD (Medicine), Professor, Full Member, R AS, General Director, National Medical Research Center of Radiology; Head, Department of Oncology and Rentenology/ Radiology, Medical Institute, RUP’s Friendship.

Obninsk, Kaluga Region; Moscow

kaprin@mail.ruМедицинский радиологический научный центр имени А.Ф. Цыба – филиал ФГБУ Национальный медицинский исследовательский центр радиологии Министерства здравоохранения РФРоссияA. Tsyb Medical Radiological Research Center, Affiliation of the National Medical Research Center of RadiologyRussian FederationТекон Медицинские приборы, ОООРоссияTekon Medical Devices LLCRussian FederationТекон Медицинские приборы, ООО; ФГБОУ ВО Московский государственный университет имени М.В. ЛомоносоваРоссияTekon Medical Devices LLC; Lomonosov State UniversityRussian FederationМедицинский радиологический научный центр имени А.Ф. Цыба – филиал ФГБУ Национальный медицинский исследовательский центр радиологии Министерства здравоохранения РФ; ФГАОУ ВО Российский университет дружбы народовРоссияA. Tsyb Medical Radiological Research Center, Affiliation of the National Medical Research Center of Radiology; Russian University of the People’s FriendshipRussian FederationФГАОУ ВО Российский университет дружбы народов; ФГБУ Национальный медицинский исследовательский центр радиологии Министерства здравоохранения РФРоссияRussian University of the People’s Friendship; National Medical Research Center of RadiologyRussian Federation202213072022243481490Copyright © Гельм Ю.В., Пасова И.А., Гривцова Л.Ю., Константинова Т.В., Михайловский Н.В., Рыбачук В.А., Абакушина Е.В., Иванов С.А., Каприн А.Д., 20222022Гельм Ю.В., Пасова И.А., Гривцова Л.Ю., Константинова Т.В., Михайловский Н.В., Рыбачук В.А., Абакушина Е.В., Иванов С.А., Каприн А.Д.Gelm Y.V., Pasova I.A., Grivtsova L.Y., Konstantinova T.V., Mikhaylovsky N.V., Rybachuk V.A., Abakushina E.V., Ivanov S.A., Kaprin A.D.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.mimmun.ru/mimmun/article/view/2481

Адоптивная иммунотерапия с использованием NK-клеток стала многообещающим терапевтическим направлением. NK-клетки являются компонентом врожденной иммунной системы, действуют как ключевые регуляторы и обладают выраженной противоопухолевой цитолитической активностью. Для того чтобы стало возможным оценить терапевтический эффект адоптивной NKклеточной иммунотерапии на доклинических этапах существует потребность в надежных протоколах для получения NK-клеток in vitro. Существует большое количество публикаций о способах активации и генерации NK-клеток человека, в том числе с использованием фидерных клеток и различных цитокинов. В статье описан опыт совместного культивирования NK-клеток от онкологических больных или доноров с фидерными клетками и без них (контрольная группа). В качестве фидера использовали клеточную линию К562 после облучения двух видов: после генной модифицикации К562 (гмК562) мембраносвязанными mbIL15, mbIL21 и без нее. NK-клетки смешивали с фидером в соотношении 1:1, 1:2 и 1:5 на 0-й, 7-й и 14-й день соответственно. Ежедневная морфологическая оценка показала, что после 3 суток культивирования NK-клетки как доноров, так и онкологических больных начинали пролиферировать и увеличиваться в размерах, а жизнеспособность фидерных клеток начинала снижаться, и к окончанию сроков культивирования составляла менее 20%. В контрольной группе без фидера после 3-го дня культивирования NK-клетки доноров и онкологических больных уходили в апоптоз, уровень их жизнеспособности снижался до 70%.

Проведена сравнительная оценка двух разных способов получения NK-клеток человека. Показано, что при выделении NK-клеток после магнитной селекции доля CD3-CD56+CD16+ клеток составляла более 90%, а после удаления адгезивных клеток – не менее 60%. При культивировании NK-клеток онкологических больных после магнитной селекции совместно с гмК562 на 21-е сутки количество NK-клеток увеличивалось в 85 раз. При культивировании NK-клеток доноров совместно с обычными К562 на 21-е сутки количество NK-клеток увеличивалось только до 8 раз. Показано, что в супернатантах, собранных в процессе культивирования NK-клеток с фидерными клетками двух видов, многократно увеличивались концентрации TNFα и IFNγ относительно контрольной группы. Экспериментальным путем подобраны оптимальные условия генерации NK-клеток.

Adoptive immunotherapy using NK cells has become a promising therapeutic area. NK cells are a component of the innate immune system, act as key regulators, and have potent antitumor cytolytic activity. In order to be able to evaluate the therapeutic effect of adoptive NK cell immunotherapy at preclinical stages, there is a need for reliable protocols for in vitro production of NK cells. There are a large number of publications on methods for activating and generating human NK cells, including using feeder-cells and various cytokines. The article describes the experience of cultivation of NK cells from cancer patients or donors with feedercells and without feeder-cells (control group). The K562 cell line was used as a feeder after irradiation of two types: after gene modification of K562 (gmK562) with membrane-bound mbIL15, mbIL21 and without it. NK cells donors and cancer patients were mixed with K562 in a ratio of 1:1, 1:2 and 1:5 on 0, 7 and 14 days respectively. Daily morphological assessment showed that, NK cells donors and cancer patients began to proliferate and increase in size, while the viability of feeder cells began to decrease after 3 days of cultivation, and they were less than 20% on 21 days. NK cells of donors and cancer patients went into apoptosis, their viability level decreased to 70% in the control group (without feeder-cells) after 3 days of cultivation. A comparative evaluation of two different methods of obtaining human NK cells was carried out. It was shown when NK cells were isolated by magnetic selection, the proportion of CD3-CD56+CD16+ cells were more than 90%, and after the removal of adherent cells, it was at least 60%. When cultivating NK cells cancer patients (after magnetic separation) together with gmK562 on the 21st day, it was possible to increase the number of NK cells up to 85 times. When cultivating NK cells donors (after adhesion) together with non-genetically modified K562 cells on 21 days, it was possible to increase the number of NK cells up to 8 times. It was shown that in the supernatants collected during the cultivation of NK cells with feeder cells (both irradiated with K562 and genetically modified with K562), the concentrations of TNFα and IFNγ increased many times relative to the control group. The optimal conditions for culturing NK cells were experimentally selected to obtain a large number of NK cells.

NK-клеткимононуклеарные клеткифидерные клеткикультивированиепролиферацияИФАфенотипNK cellsmononuclear cellsfeeder cellscultureproliferationELISAphenotypeReferencesАбакушина Е.В., Маризина Ю.В., Каприн А.Д. Морфофункциональная характеристика лимфоцитов человека после активации in vitro // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2016. Т. 161, № 5. С. 678-683.Abakushina E.V., Marizina Y.V., Kaprin A.D. Morphofunctoinal characteristics of human lymphosytes after in vitro activation. Byulleten eksperimentalnoy biologii i meditsiny = Bulletin of Experimental Biology and Medicine, 2016, Vol. 161, no. 5, pp. 678-683. (In Russ.)Абакушина Е.В., Маризина Ю.В., Неприна Г.С. Эффективность совместного применения IL-2 и IL-15 для активации цитотоксических лимфоцитов in vitro // Гены и клетки, 2015. Т. 10, № 2. C. 78-85.Abakushina E.V., Marizina Yu.V., Neprina G.S. Efficiency of IL-2 and IL-15 combined use for activation of cytotoxic lymphocytes in vitro. Geny i kletki = Genes and Cells, 2015, Vol. 10, no. 2, pp. 78-85. (In Russ.)Абакушина Е.В., Пасова И.А., Маризина Ю.В., Кудрявцев Д.В., Кудрявцева Г.Т., Фомина Е.С. Клиническая эффективность сопроводительной иммунотерапии активированными лимфоцитами больной меланомой (случай из практики) // Сибирский онкологический журнал, 2016. Т. 15, № 5. С. 89-94.Abakushina E.V., Pasova I.A., Marizina Yu.V., Kudryavtsev D.V., Kudryavtseva G.T., Fomina E.S. Efficiency of adoptive immunotherapy for melanoma: a case report. Sibirskiy onkologicheskiy zhurnal = Siberian Journal of Oncology, 2016, Vol. 15, no. 5, pp. 89-94. (In Russ.)Боробова Е.А., Жеравин А.А. Натуральные киллеры в иммунотерапии онкологических заболеваний // Сибирский онкологический журнал, 2018. Т. 17, № 6. C. 97-104.Borobova E.A., Zheravin A.A. Natural killer cels in immunotherapy for cancer. Sibirskiy onkologicheskiy zhurnal = Siberian Journal of Oncology, 2018, Vol. 17, no. 6, pp. 97-104. (In Russ.)Вашкевич Е.П., Мигас А.А., Мелешко А.Н., Матвеенко М.А., Струшкевич Н.В., Шман Т.В. Экспансия и активация естественных киллерных клеток человека ex vivo в присутствии трансгенных фидерных клеточных линий // Цитология, 2020. Т. 62, № 4. С. 258-265.Vashkevich E.P., Migas A.A., Meleshko A.N., Matveyenkaa M.A., Strushkevich N.V., Shman T.V. Human Natural Killer cells expansion and activation ex vivo in the presence of transgenic feeder cell lines. Tsitologiya = Cytology, 2020, Vol. 62, no. 4, pp. 258-265. (In Russ.)Гривцова Л.Ю. Рецепторный репертуар NK-клеток как молекулярный базис аллореактивности (литературный обзор) // Иммунология гемопоэза, 2018. Т. 16, № 1. С. 62-108.Grivtsova L.Yu. Receptor repertoire of NK-cells as a molecular basis of alloreactivity (literature review). Immunologiya gemopoeza = Immunology of Hematopoiesis, 2018, Vol. 16, no. 1, pp. 62-108. (In Russ.)Лежнин Ю.Н., Христиченко А.Ю., Ратникова Н.М., Кравченко Ю.Е., Чумаков С.П. Клеточная иммунотерапия – современный подход к лечению онкологических заболеваний // Медицинская иммунология, 2018. Т. 20, № 3. С. 313-340. doi: 10.15789/15630625-2018-3-313-340.Lezhnin Yu.N., Khristichenko A.Yu., Ratnikova N.M., Kravchenko Yu.E., Chumakov S.P. Cellular immunotherapy: a modern approach to treatment of oncological diseases. Meditsinskaya immunologiya = Medical Immunology (Russia), 2018, Vol. 20, no. 3, pp. 313-340. (In Russ.) doi: 10.15789/15630625-2018-3-313-340.Непомнящих Т.С., Антонец Д.В., Максютов Р.А. Краткий обзор клинических испытаний средств иммунотерапии онкологических заболеваний // Медицинская иммунология, 2017. Т. 19, № 2. С. 127-144. doi: 10.15789/1563-0625-2017-2-127-144.Nepomnyashchikh T.S., Antonets D.V., Maksyutov R.A. Short overview of clinical trials with current immunotherapeutic tools for cancer treatment. Meditsinskaya immunologiya = Medical Immunology (Russia), 2017, Vol. 19, no. 2, pp. 127-144. (In Russ.) doi: 10.15789/1563-0625-2017-2-127-144.Шамова Т.В., Ситковская А.О., Ващенко Л.Н., Кечеджиева Э.Э. Адоптивная клеточная терапия: достижения последних лет // Южно-российский онкологический журнал, 2020. Т. 1, № 1. С. 43-59.Shamova T.V., Sitkovskaya A.O., Vashchenko L.N., Kechedzhieva E.E. Adoptive cell therapy: Current advances. Yuzhno-rossiyskiy onkologicheskiy zhurnal = South Russian Journal of Cancer, 2020, Vol. 1, no. 1, pp. 43-59. (In Russ.)Abakushina E.V., Gelm Yu.V., Pasova I.A., Bazhin A.V. Immunotherapeutic approaches for the treatment of colorectal cancer. J. Biochemistry (Moscow), 2019, Vol. 84, no. 7, pp. 720-728.Abakushina E.V., Gelm Yu.V., Pasova I.A., Bazhin A.V. Immunotherapeutic approaches for the treatment of colorectal cancer. J. Biochemistry (Moscow), 2019, Vol. 84, no. 7, pp. 720-728.del Zotto G., Marcenaro E., Vacca P., Sivori S., Pende D., Della Chiesa M., Moretta F., Ingegnere T., Mingari M.C., Moretta A., Moretta L. Markers and function of human NK cells in normal and pathological conditions. J. Cytometry B Clin. Cytom., 2017, Vol. 92, no. 2, pp. 100-114.del Zotto G., Marcenaro E., Vacca P., Sivori S., Pende D., Della Chiesa M., Moretta F., Ingegnere T., Mingari M.C., Moretta A., Moretta L. Markers and function of human NK cells in normal and pathological conditions. J. Cytometry B Clin. Cytom., 2017, Vol. 92, no. 2, pp. 100-114.Fang F., Xiao W., Tian Z. NK cell-based immunotherapy for cancer. J. Semin Immunol., 2017, Vol. 31, pp. 37-54.Fang F., Xiao W., Tian Z. NK cell-based immunotherapy for cancer. J. Semin Immunol., 2017, Vol. 31, pp. 37-54.Granzin M., Wagner J., Kohl U., Cerwenka A., Huppert V., Ullrich E. Shaping of natural killer cell antitumor activity by ex vivo cultivation. J. Front. Immunol., 2017, Vol. 8, 458. doi: 10.3389/fimmu.2017.00458.Granzin M., Wagner J., Kohl U., Cerwenka A., Huppert V., Ullrich E. Shaping of natural killer cell antitumor activity by ex vivo cultivation. J. Front. Immunol., 2017, Vol. 8, 458. doi: 10.3389/fimmu.2017.00458.Lee D.A. Cellular therapy: Adoptive immunotherapy with expanded natural killer cells. J. Immunol. Rev., 2019, Vol. 1, no. 290, pp. 85-99.Lee D.A. Cellular therapy: Adoptive immunotherapy with expanded natural killer cells. J. Immunol. Rev., 2019, Vol. 1, no. 290, pp. 85-99.Shin M.H., Kim J., Lim S.A., Kim J., Kim S.J., Lee K.M. NK Cell-Based immunotherapies in cancer. J. Immune Netw, 2020, Vol. 20, no. 2, e14. doi: 10.4110/in.2020.20.e14.Shin M.H., Kim J., Lim S.A., Kim J., Kim S.J., Lee K.M. NK Cell-Based immunotherapies in cancer. J. Immune Netw, 2020, Vol. 20, no. 2, e14. doi: 10.4110/in.2020.20.e14.Tarazona R., Lopez-Sejas N., Guerrero B., Hassouneh F., Valhondo I., Pera A., Sanchez-Correa B., Pastor N., Duran E., Alonso C., Solana R. Current progress in NK cell biology and NK cell-based cancer immunotherapy. J. Cancer Immunol. Immunother., 2020, Vol. 5, no. 69, pp. 879-899.Tarazona R., Lopez-Sejas N., Guerrero B., Hassouneh F., Valhondo I., Pera A., Sanchez-Correa B., Pastor N., Duran E., Alonso C., Solana R. Current progress in NK cell biology and NK cell-based cancer immunotherapy. J. Cancer Immunol. Immunother., 2020, Vol. 5, no. 69, pp. 879-899.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.