mimmunМедицинская иммунологияMedical Immunology (Russia)1563-06252313-741XSPb RAACI10.15789/1563-0625-EOD-2243mimmun-2243Research ArticleМАТЕРИАЛЫ ФОРУМА "ДНИ ИММУНОЛОГИИ В СПБ" 2021ВЛИЯНИЕ ЭЛЕКТРОПОРАЦИИ ДНК КОНСТРУКЦИЯМИ НА ДЕНДРИТНЫЕ КЛЕТКИEFFECT OF DNA CONSTRUCTIONS ELECTROPORATION ON DENDRITIC CELLShttps://orcid.org/0000-0001-9055-6069БулыгинА. С.BulyginA. S.

аспирант лаборатории молекулярной иммунологии,

630099, г. Новосибирск, ул. Ядринцевская, 14

aleksej.bulygin95@mail.ruТерещенкоВ. П.TereshchenkoV. P.

младший научный сотрудник лаборатории молекулярной иммунологии,

630099, г. Новосибирск, ул. Ядринцевская, 14

tervp91@gmail.comЗаводскийР. Ю.ZavodskiiR. Yu.

аспирант лаборатории молекулярной иммунологии,

630099, г. Новосибирск, ул. Ядринцевская, 14

zavodskii.1448@gmail.comОблеуховаИ. А.ObleukhovaI. A.

к.б.н., старший научный сотрудник лаборатории молекулярной иммунологии,

630099, г. Новосибирск, ул. Ядринцевская, 14

obleukhova.irina@yandex.ruСенниковС. В.SennikovS. V.

д.м.н., заведующий лабораторией молекулярной иммунологии,

630099, г. Новосибирск, ул. Ядринцевская, 14

sennilovsv@gmail.comСилковА. Н.SilkovA. N.

д.б.н., директор,

630099, г. Новосибирск, ул. Ядринцевская, 14

exon@ngs.ruФГБНУ «Научно-исследовательский институт фундаментальной и клинической иммунологии»РоссияResearch Institute of Fundamental and Clinical ImmunologyRussian Federation202107102021234653658Copyright © Булыгин А.С., Терещенко В.П., Заводский Р.Ю., Облеухова И.А., Сенников С.В., Силков А.Н., 20212021Булыгин А.С., Терещенко В.П., Заводский Р.Ю., Облеухова И.А., Сенников С.В., Силков А.Н.Bulygin A.S., Tereshchenko V.P., Zavodskii R.Y., Obleukhova I.A., Sennikov S.V., Silkov A.N.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.mimmun.ru/mimmun/article/view/2243

На сегодняшний день, трансфекция клеток млекопитающих ДНК или РНК конструкциями является единственным методом доставки запрограммированной информации в ядро клетки. Одним из часто используемых методов трансфекции в работе с дендритными клетками, является электропорация. Суть метода состоит в повышении проницаемости мембраны путем проведения электрического импульса через клетку. В связи с повышенной проницаемостью мембраны повышается шанс попадания ДНК или РНК конструкций внутрь клетки, но при этом снижается выживаемость клетки после воздействия тока на плазматическую мембрану клетки.

В исследовании использовали мышей самцов линии C57Bl/6 возраста 2-4 месяца. Из бедренной кости мышей выделяли 20 × 106 клеток костного мозга, после клетки культивировали в полной RPMI1640 среды в течение 7 суток. Для генерации дендритных клеток из клеток костного мозга, в культуральную среду добавляли 100 нг/мл rmFlt3-L на 0 день. После 7 дней культивирования, клеточную культуру электропорировали контрольными некодирующими плазмидами p5 (EP P5) или пламзмидами pmaxCCR9 (EP CCR9), кодирующими мышиный рецептор хемотаксиса CCR9. В качестве контролей выступали, клеточные культуры электропорированные без плазмид (mock EP) и культуры клеток без электропорации (none EP). Электропорировали 5 × 105 клеток и оставляли на 10 минут. После 10 минут клетки собирались и рассаживались в 24-луночном планшете в 1 мл культуральной среды и кондиционной среды (1:1). Затем добавляли по 50 нг/мл Flt3-L в каждую лунку. На следующий день трансфицированные клетки оценивались с помощью метода проточной цитофлуориметрии и количественной ПЦР.

Установлено, что после электропорации в группах mock EP, EP P5, EP CCR9 относительное количество живых CD11c+ дендритных клеток было достоверно меньше, чем в non EP группе. Более того, в группах EP P5 и EP CCR9 было достоверно меньше живых CD11c+ дендритных клеток, чем в группе mock EP. Экспрессия маркера CD86 было достоверно выше в группах EP P5 и EP CCR9, чем в группах non EP и mock EP. Экспрессия I-Ab среди cDC2s было достоверно выше в группе EP CCR9 по сравнению с группой non EP. У плазмацитоидных дендритных клеток и конвенциональных дендритных клеток 2-го типа, в группах EP CCR9, экспрессия CCR9 была достоверно выше, чем в группе non EP.

Таким образом, в данном исследовании продемонстрирована эффективность электропорации, сопровождающаяся снижением выживаемости и созреванием дендритных клеток. 

Today transfection of mammalian cell with DNA or RNA construction is the only method for delivering programmed information into the cell nucleus. Electroporation is most commonly used method of transfection in experiments with dendritic cell. The aim of electroporation is to permeabilize the membrane by passing electric impulse through the cell. Due to the increase permeability of the membrane chance DNA or RNA construction getting inside into the cell is increased, wherein survival of the cells is decreased.

In the study male mice C57Bl/6 line 2-4 months old were used. From femur bones was isolated 20 × 106 bone marrow cells, which were cultured in 20 mL of complete RPMI-1640 for 7 days. To generate dendritic cells from BM cells, 100 ng/mL of rmFlt3-L was added to culture media at day 0. After 7 days of cultivation, the cell cultures were electroporated with control noncoding plasmids p5 (EP P5) or pmaxCCR9 encoding mouse chemokine receptor CCR9 (EP CCR9). The controls were cell cultures electroporated without any plasmids (mock EP) and cell cultures without electroporation (none EP). 5 × 105 cells were electroporated and resting for 10 minutes. After 10 minutes, cells were harvested and seeded into 24-well plates in 1 mL of culture medium and conditioning medium (1:1). Then, 50 ng/mL of Flt3-L was added to each well. The next day, transfected cells were collected and used for flow cytometry, qRT-PCR analysis.

It was found that after electroporation in the groups mock EP, EP P5, EP CCR9 relative amount of live CD11c+ dendritic cells was significantly less than in the non EP group. Moreover, in the EP P5 and EP CCR9 groups the frequency of live CD11c+ dendritic cells was significantly less than in the mock EP group. Expression of the CD86 marker in the EP P5 and EP CCR9 groups was significantly higher than in the non EP and mock EP groups. Expression of the I-AB(MHCII) in the EP CCR9 group on cDC2s was significantly higher than in the non EP group. On plasmacytoid DCs (pDCs) and conventional type 2 DCs (cDC2s) in the EP CCR9 group expression of CCR9 was significantly higher than in the non EP group. Therefore, in this study, we demonstrated the effectiveness of electroporation, accompanied by the decrease in the survival rate and maturation of DCs. 

электропорацияплазмацитоидные дендритные клеткиконвенциональные дендритные клетки 2-го типаДНК конструкциижизнеспособностьзрелостьelectroporationplasmacytoid dendritic cellsconventional dendritic cell type 2DNA constructionsviabilitymaturityThe study was supported by the Russian Science Foundation (Agreement No. 16-15-00086).ReferencesBaravalle G., Park H., McSweeney M., Ohmura-Hoshino M., Matsuki Y., Ishido S., Shin J.-S. Ubiquitination of CD86 is a key mechanism in regulating antigen presentation by dendritic cells. J. Immunol., 2011, Vol. 187, pp. 2966-2973.Baravalle G., Park H., McSweeney M., Ohmura-Hoshino M., Matsuki Y., Ishido S., Shin J.-S. Ubiquitination of CD86 is a key mechanism in regulating antigen presentation by dendritic cells. J. Immunol., 2011, Vol. 187, pp. 2966-2973.Casares D., Escribá P.V., Rosselló C.A. Membrane lipid composition: effect on membrane and organelle structure, function and compartmentalization and therapeutic avenues. Int. J. Mol. Sci., 2019, Vol. 20, 2167. doi: 10.3390/ijms20092167.Casares D., Escribá P.V., Rosselló C.A. Membrane lipid composition: effect on membrane and organelle structure, function and compartmentalization and therapeutic avenues. Int. J. Mol. Sci., 2019, Vol. 20, 2167. doi: 10.3390/ijms20092167.Drakes M.L., Stiff P.J., Blanchard T.G. Inverse relationship between dendritic cell CCR9 expression and maturation state. Immunology, 2009, Vol. 127, pp. 466-476.Drakes M.L., Stiff P.J., Blanchard T.G. Inverse relationship between dendritic cell CCR9 expression and maturation state. Immunology, 2009, Vol. 127, pp. 466-476.Kadir L.A., Stacey M., Barrett-Jolley R. Emerging roles of the membrane potential: action beyond the action potential. Front. Physiol., 2018, Vol. 9, 1661. doi: 10.3389/fphys.2018.01661.Kadir L.A., Stacey M., Barrett-Jolley R. Emerging roles of the membrane potential: action beyond the action potential. Front. Physiol., 2018, Vol. 9, 1661. doi: 10.3389/fphys.2018.01661.Lenz P., Bacot S.M., Frazier-Jessen M.R., Feldman G.M. Nucleoporation of dendritic cells: efficient gene transfer by electroporation into human monocyte-derived. FEBS Lett., 2003, Vol. 538, no. 1-3, pp. 149-154.Lenz P., Bacot S.M., Frazier-Jessen M.R., Feldman G.M. Nucleoporation of dendritic cells: efficient gene transfer by electroporation into human monocyte-derived. FEBS Lett., 2003, Vol. 538, no. 1-3, pp. 149-154.Li J.G., Du Y.M., Yan Z.D., Yan J., Zhuansun Y.X., Chen R., Zhang W., Feng S.L., Ran P.X. CD80 and CD86 knockdown in dendritic cells regulates Th1/Th2 cytokine production in asthmatic mice. Exp. Ther. Med., 2016, Vol. 11, pp. 878-884.Li J.G., Du Y.M., Yan Z.D., Yan J., Zhuansun Y.X., Chen R., Zhang W., Feng S.L., Ran P.X. CD80 and CD86 knockdown in dendritic cells regulates Th1/Th2 cytokine production in asthmatic mice. Exp. Ther. Med., 2016, Vol. 11, pp. 878-884.Livak K.J., Schmittgen T.D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods, 2001, Vol. 25, pp. 402-408.Livak K.J., Schmittgen T.D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods, 2001, Vol. 25, pp. 402-408.Milano F., Krishnadath K.K. Electroporation of dendritic cells with autologous total RNA from tumor material. Methods Mol. Biol., 2014, Vol. 1139, pp. 87-95.Milano F., Krishnadath K.K. Electroporation of dendritic cells with autologous total RNA from tumor material. Methods Mol. Biol., 2014, Vol. 1139, pp. 87-95.Molnar M.J., Gilbert R., Lu Y. Factors influencing the efficacy, longevity, and safety of electroporationassisted plasmid-based gene transfer into mouse muscles. Mol. Ther., 2004, Vol. 10, pp. 447-455.Molnar M.J., Gilbert R., Lu Y. Factors influencing the efficacy, longevity, and safety of electroporationassisted plasmid-based gene transfer into mouse muscles. Mol. Ther., 2004, Vol. 10, pp. 447-455.Panagiotopoulou V. Study on cell membrane electrostatics and transport. Book, Lambert Academic Publishing, 2015. 98 p.Panagiotopoulou V. Study on cell membrane electrostatics and transport. Book, Lambert Academic Publishing, 2015. 98 p.Patente T.A., Pelgrom L.R., Everts B. Dendritic cells are what they eat: how their metabolism shapes T helper cell polarization. Curr. Opin. Immunol., 2019, Vol. 58, pp. 16-23.Patente T.A., Pelgrom L.R., Everts B. Dendritic cells are what they eat: how their metabolism shapes T helper cell polarization. Curr. Opin. Immunol., 2019, Vol. 58, pp. 16-23.Pearce E.J., Everts B. Dendritic cell metabolism. Nat. Rev. Immunol., 2015, Vol. 15, pp. 18-29.Pearce E.J., Everts B. Dendritic cell metabolism. Nat. Rev. Immunol., 2015, Vol. 15, pp. 18-29.Rols M.P. Parameters affecting cell viability following electroporation in vitro. Handbook of Electroporation, Springer International Publishing, 2017, pp. 1449-1465.Rols M.P. Parameters affecting cell viability following electroporation in vitro. Handbook of Electroporation, Springer International Publishing, 2017, pp. 1449-1465.Sukharev S.I., Klenchin V.A., Serov S.M., Chernomordik L.V., Chizmadzhev Y.A. Electroporation and electrophoretic DNA transfer into cells. Biophys. J., 1992, Vol. 63, pp. 1320-1327.Sukharev S.I., Klenchin V.A., Serov S.M., Chernomordik L.V., Chizmadzhev Y.A. Electroporation and electrophoretic DNA transfer into cells. Biophys. J., 1992, Vol. 63, pp. 1320-1327.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.