mimmunМедицинская иммунологияMedical Immunology (Russia)1563-06252313-741XSPb RAACI10.15789/1563-0625-SOT-2051mimmun-2051Research ArticleОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИORIGINAL ARTICLESИзучение влияния наночастиц оксида графена на люминол-зависимую хемилюминесценцию лейкоцитов человекаStudy of the graphene oxide nanoparticles effect on luminol-dependent chemiluminescence of human leukocytesБочковаМ. С.BochkovaM. S.

Бочкова Мария Станиславовна – кандидат биологических наук, научный сотрудник лаборатории экологической иммунологии

614081, г. Пермь, ул. Голева, 13

Bochkova Maria S., PhD (Biology), Research Associate, Laboratory of Ecological Immunology

614081, Perm, Golev str., 13.

krasnykh-m@mail.ruТимгановаВ. П.TimganovaV. P.

Тимганова Валерия Павловна – кандидат биологических наук, научный сотрудник лаборатории экологической иммунологии

614081, г. Пермь, ул. Голева, 13

PhD (Biology), Research Associate, Laboratory of Ecological Immunology

614081, Perm, Golev str., 13.

timganovavp@gmail.comХрамцовП. В.KhramtsovP. V.

Храмцов Павел Викторович – кандидат биологических наук, младший научный сотрудник лаборатории экологической иммунологии

614081, г. Пермь, ул. Голева, 13

PhD (Biology), Junior Research Associate, Laboratory of Ecological Immunology

614081, Perm, Golev str., 13.

khramtsovpavel@yandex.ruУжвиюкС. В.UzhviyukS. V.

Ужвиюк Софья Вадимовна – инженер лаборатории экологической иммунологии

614081, г. Пермь, ул. Голева, 13

Engineer, Laboratory of Ecological Immunology

614081, Perm, Golev str., 13.

kochurova.sofja@yandex.ruШардинаК. Ю.ShardinaK. Yu.

Шардина Ксения Юрьевна – инженер лаборатории экологической иммунологии

614081, г. Пермь, ул. Голева, 13

Engineer, Laboratory of Ecological Immunology

614081, Perm, Golev str., 13.

shardinak@gmail.comНечаевА. И.NechaevA. I.

Нечаев Антон Игоревич – инженер лаборатории экологической иммунологии

614081, г. Пермь, ул. Голева, 13

Engineer, Laboratory of Ecological Immunology

614081, Perm, Golev str., 13.

Nechaev.a@itcras.ruРаевМ. Б.RaevM. B.

Раев Михаил Борисович – доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории экологической иммунологии

614081, г. Пермь, ул. Голева, 13

PhD, MD (Biology), Leading Research Associate, Laboratory of Ecological Immunology

614081, Perm, Golev str., 13.

mraev@iegm.ruЗаморинаС. А.ZamorinaS. A.

Заморина Светлана Анатольевна – доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории экологической иммунологии

614081, г. Пермь, ул. Голева, 13

PhD, MD (Biology), Leading Research Associate, Laboratory of Ecological Immunology

614081, Perm, Golev str., 13.

mantissa7@mail.ruИнститут экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения Российской академии наук – филиал ФГБУН «Пермский федеральный исследовательский центр Уральского отделения Российской академии наукРоссияInstitute of Ecology and Genetics of Microorganisms of the Ural Branch of the Russian Academy of Sciences, Branch of Perm Federal Research Center of the Ural Branch of the Russian Academy of SciencesRussian Federation202027112020225977986Copyright © Бочкова М.С., Тимганова В.П., Храмцов П.В., Ужвиюк С.В., Шардина К.Ю., Нечаев А.И., Раев М.Б., Заморина С.А., 20202020Бочкова М.С., Тимганова В.П., Храмцов П.В., Ужвиюк С.В., Шардина К.Ю., Нечаев А.И., Раев М.Б., Заморина С.А.Bochkova M.S., Timganova V.P., Khramtsov P.V., Uzhviyuk S.V., Shardina K.Y., Nechaev A.I., Raev M.B., Zamorina S.A.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.mimmun.ru/mimmun/article/view/2051

Графен и его производные все чаще используются в биомедицинских исследованиях, поэтому в настоящее время усиленно изучаются механизмы и последствия взаимодействия наночастиц графена с живым объектами. Иммунная система участвует в защите организма человека и регуляции его функций, поэтому вопрос о воздействии графена и его производных на иммунные клетки является принципиальным. Специфическим ответом моноцитов, макрофагов и нейтрофилов на стимул или раздражитель является увеличение продукции активных форм кислорода (АФК). Поскольку литературные данные по влиянию оксида графена (ОГ) и пегилированного оксида графена (ОГ-ПЭГ) на лейкоциты периферической крови немногочисленны и противоречивы, ввиду использования разных концентрации частиц, разных условий и различных объектов исследования, представлялось важным оценить влияние ОГ и ОГ-ПЭГ на продукцию АФК лейкоцитами человека. Целью нашего исследования явилось изучение влияния частиц немодифицированного и модифицированного ПЭГ оксида графена на продукцию АФК лейкоцитами периферической крови в тесте спонтанной и стимулированной люминол-зависимой хемилюминесценции (ЛЗХЛ). Стимуляцию продукции АФК осуществляли опсонизированным зимозаном (ОЗ). Для оценки самостоятельного эффекта наночастиц на тушение люминесценции использовали бесклеточную систему с люминолом и перекисью водорода. В работе использовали наночастицы ОГ (Оssila, Великобритания), с поверхностью, модифицированной ПЭГ (ОГ-ПЭГ). Средний размер пластин ОГ составлял 1-5 мкм, ОГ-ПЭГ после модификации 569±14 нм, количество покрывающего ПЭГ ~ 20%. Наночастицы применяли в концентрациях 5; 2,5; 1,25 мкг/мл. Установлено, что наночастицы ОГ-ПЭГ в концентрациях 2,5 и 5 мкг/мл угнетали продукцию АФК в спонтанном варианте ЛЗХЛ, в то время как эффекты ОГ демонстрировали видимую, но не достоверную тенденцию к угнетению ЛЗХЛ. Аналогичные результаты были получены в стимулированном варианте ЛЗХЛ. Однако при анализе процесса в кинетике продукцию АФК снижали как ОГ-ПЭГ, так и ОГ, преимущественно в первые минуты теста. При анализе эффекта тушения люминесценции в бесклеточной системе достоверного влияния наночастиц ОГ и ОГ-ПЭГ выявлено не было. Таким образом, общий вектор полученных эффектов был связан с подавлением продукции АФК. Депрессивные эффекты ОГ-ПЭГ на продукцию АФК лейкоцитами были более выраженными в сравнении с немодифицированным ОГ. В целом нами были подтверждены антиоксидантные эффекты ОГ и ОГ-ПЭГ при помощи метода ЛЗХЛ. Можно предположить, что, помимо собственно антиоксидантного эффекта наночастиц графена, продукция АФК снижается вследствие быстрого поглощения ОГ и блокирования ряда внутриклеточных сигналов, индуцирующих респираторный взрыв.

Graphene and its derivatives are increasingly used in biomedical research. Therefore, the mechanisms and consequences of the interaction of graphene nanoparticles with living objects are intensively studied. The immune system is involved in protecting the body and regulating its functions, so the question of the effect of graphene and its derivatives on immune cells is crucial. The specific response of monocytes, macrophages, and neutrophils to a stimulus is to increase the production of reactive oxygen species (ROS). Published data on graphene oxide (GO) and polyethylene glycol-modified graphene oxide (GO-PEG) effects on peripheral blood leukocytes are scarce and contradictory. It is due to variations in objects and conditions of study, along with the difference in particle concentrations. Thus, it was essential to evaluate the GO and GO-PEG effect on ROS production by human leukocytes. Our study aimed at the effect of particles of unmodified and PEG-modified graphene oxide (GO and GO-PEG) on the ROS production by peripheral blood leukocytes in not-stimulated and stimulated luminoldependent chemiluminescence (LCL) tests. ROS production was stimulated by opsonized zymosan (OZ). A hydrogen peroxide-luminol system was used for assessing the independent effect of GO nanoparticles on the quenching of ROS luminescence. Pristine GO (Ossila, Great Britain) nanoparticles were PEG-modified (GO-PEG). The average size of the GO flakes was 1-5 µm, the GO-PEG-flakes 569±14 nm, and the amount of PEG covering was ~ 20%. Nanoparticles were used at concentrations of 5; 2.5; 1.25 µg/ml. It has been established that GO-PEG nanoparticles in concentrations of 2.5 and 5 µg/ml suppressed ROS production in the spontaneous LCL test. At the same time, the GO effects showed a visible but a not significant tendency to inhibition of LCL. Similar results were obtained in the stimulated LCL test. However, when analyzing the process kinetics, both GO-PEG and GO decreased the ROS production, but mainly in the first minutes of the test. When analyzing the quenching effect of the LCL reaction in a cell-free system, there was no significant effect of GO and GO-PEG nanoparticles. Thus, the general vector of the obtained effects was associated with the suppression of ROS production. GO-PEG ROS-decreasing effects were more pronounced in comparison with unmodified GO. In general, we have confirmed the antioxidant effects of GO and GO-PEG using the LCL method. We can assume that in addition to the actual antioxidant effect of graphene nanoparticles, ROS production decreases due to the rapid GO uptake and blocking of several intracellular signals that induce an oxidative burst.

оксид графенаполиэтиленгликольлюминол-зависимая хемилюминесценциялейкоцитыактивные формы кислородаgraphene oxidepolyethylene glycolluminol-dependent chemiluminescenceleukocytesreactive oxygen speciesРабота выполнена при поддержке гранта РНФ 19-15-00244ReferencesBaali N., Khecha A., Bensouici A., Speranza G., Hamdouni N. Assessment of antioxidant activity of pure graphene oxide (GO) and ZnO-decorated reduced graphene oxide (rGO) using dpph radical and H2O2 scavenging assays. J. Carbon Res., 2019, Vol. 5, no. 4, 75. doi: 10.3390/c5040075.Baali N., Khecha A., Bensouici A., Speranza G., Hamdouni N. Assessment of Antioxidant Activity of Pure Graphene Oxide (GO) and ZnO-Decorated Reduced Graphene Oxide (rGO) Using DPPH Radical and H2O2 Scavenging Assays. Journal of Carbon Research, 2019, Vol. 5, pp. 75.Bedouhène S., Moulti-Mati F., Hurtado-Nedelec M., Dang P.M., El-Benna J. Luminol-amplified chemiluminescence detects mainly superoxide anion produced by human neutrophils. Am. J. Blood Res., 2017, Vol. 7, no. 4, pp. 41-48.Bedouhène S., Moulti-Mati F., Hurtado-Nedelec M., Dang P. M., El-Benna J. Luminol-amplified chemiluminescence detects mainly superoxide anion produced by human neutrophils. American journal of blood research, 2017, Vol. 7, no. 4, pp. 41–48.Bi S., Zhao T., Luo B. A graphene oxide platform for the assay of biomolecules based on chemiluminescence resonance energy transfer. Chem. Commun., 2012, Vol. 48, Iss. 1, pp. 106-108.Bi S., Zhao T., Luo B. A graphene oxide platform for the assay of biomolecules based on chemiluminescence resonance energy transfer. Chemical Communications, 2012, Vol. 48, iss.1, pp. 106-108.Han J., Kim Y.S., Lim M.Y., Kim H.Y., Kong S., Kang M., Choo Y.W., Jun J.H., Ryu S., Jeong H.Y., Park J., Jeong G.J., Lee J.C., Eom G.H., Ahn Y., Kim B.S. Dual roles of graphene oxide to attenuate inflammation and elicit timely polarization of macrophage phenotypes for cardiac repair. ACS Nano, 2018, Vol. 12, pp. 1959-1977.Han J., Kim Y.S., Lim M.Y., Kim H.Y., Kong S., Kang M., Choo Y.W., Jun J.H., Ryu S., Jeong H.Y., Park J., Jeong G.J., Lee J.C., Eom G.H., Ahn Y., Kim B.S. Dual Roles of Graphene Oxide To Attenuate Inflammation and Elicit Timely Polarization of Macrophage Phenotypes for Cardiac Repair. ACS Nano., 2018, Vol. 12, pp. 1959−1977.Kelly E.K., Wang L., Ivashkiv L.B. Calcium-activated pathways and oxidative burst mediate zymosaninduced signaling and IL-10 production in human macrophages. J. Immunol., 2010, Vol. 184, Iss. 10. pp. 5545-5552.Kelly E.K., Wang L., Ivashkiv L.B. (2010). Calcium-activated pathways and oxidative burst mediate zymosan-induced signaling and IL-10 production in human macrophages. Journal of immunology, 2010, Vol. 184, iss. 10. pp. 5545-5552.Lee M.Y., Kim S.Y., Kim H.G., In I. Chemiluminescence quenching of luminol-functionalized chemically reduced graphene oxide through noncovalent interaction. Chem. Lett., 2013, Vol. 42, no. 1, pp. 48-49.Lee, M.Y., Kim, S.Y., Kim, H.G., In, I. Chemiluminescence quenching of luminol-functionalized chemically reduced graphene oxide through noncovalent interaction. Chemistry Letters, 2013, Vol. 42, no.1, pp. 48-49.Marković Z.M., Jovanović S.P., Mašković P.Z., Mojsin M.M., Stevanović M.J., Danko M., Mičušík M., Jovanović D.J., Kleinová A., Špitalský Z., Pavlović V.B., Todorović Marković B.M. Graphene oxide size and structure pro-oxidant and antioxidant activity and photoinduced cytotoxicity relation on three cancer cell lines. J. Photochem. Photobiol. B, 2019, Vol. 200, 111647. doi: 10.1016/j.jphotobiol.2019.111647.Marković Z.M., Jovanović S.P., Mašković P.Z., Mojsin M.M., Stevanović M.J., Danko M., Mičušík M., Jovanović D.J., Kleinová A., Špitalský Z., Pavlović V.B., Todorović Marković B.M. Graphene oxide size and structure pro-oxidant and antioxidant activity and photoinduced cytotoxicity relation on three cancer cell lines. Journal of Photochemistry and photobiology. B, 2019, Vol. 200, Article 111647.Mendes R.G., Mandarino A., Koch B., Meyer A.K., Bachmatiuk A., Hirsch C., Gemming T., Schmidt O.G., Liu Z., Rümmeli M.H. Size and time dependent internalization of label-free nano-graphene oxide in human macrophages. Nano Res., 2017, Vol. 10, pp. 1980-1995.Mendes R.G., Mandarino A., Koch B., Meyer A.K., Bachmatiuk A., Hirsch C., Gemming T., Schmidt O.G., Liu Z., Rümmeli M.H. Size and time dependent internalization of label-free nano-graphene oxide in human macrophages. Nano Res., 2017, Vol. 10, pp. 1980–1995.Nilewski L., Mendoza K., Jalilov A.S., Berka V., Wu G., Sikkema W.K.A., Metzger A., Ye R., Zhang R., Luong D.X., Wang T., McHugh E., Derry P.J., Samuel E.L., Kent T.A., Tsai A.L., Tour J.M. Highly oxidized graphene quantum dots from coal as efficient antioxidants. ACS Appl. Mater. Interfaces., 2019, Vol. 11, Iss. 18, pp. 16815-16821.Nilewski L., Mendoza K., Jalilov A.S., Berka V., Wu G., Sikkema W.K.A., Metzger A., Ye R., Zhang R., Luong D. X., Wang T., McHugh E., Derry P.J., Samuel E. L., Kent T.A., Tsai A.L., Tour J.M. Highly Oxidized Graphene Quantum Dots from Coal as Efficient Antioxidants. ACS Appl. Mater. Interfaces., 2019, Vol. 11, iss. 18, pp. 16815-16821.Povedailo V.A., Ronishenko B.V., Stepuro V.I., Tsybulsky D.A., Shmanai V.V., Yakovlev D.L. Fluorescence quenching of dyes by graphene oxide. J. Appl. Spectro., 2018, Vol. 85, pp. 605-610.Povedailo V.A., Ronishenko B.V., Stepuro V.I., Tsybulsky D.A., Shmanai V.V., Yakovlev D.L. Fluorescence Quenching of Dyes by Graphene Oxide. Journal of Applied Spectroscopy, 2018, Vol. 85, pp. 605–610.Qiu Y., Wang Z., Owens A.C., Kulaots I., Chen Y., Kane A.B., Hurt R.H. Antioxidant chemistry of graphenebased materials and its role in oxidation protection technology. Nanoscale, 2014, Vol. 6, Iss. 20, pp. 11744-11755.Qiu Y., Wang Z., Owens A.C., Kulaots I., Chen Y., Kane A.B., Hurt R.H. Antioxidant Chemistry of Graphene-Based Materials and its Role in Oxidation Protection Technology. Nanoscale, 2014, Vol. 6, iss. 20, pp. 11744−11755.Ren C., Hu X., Zhou Q. Graphene oxide quantum dots reduce oxidative stress and inhibit neurotoxicity in vitro and in vivo through catalase-like activity and metabolic regulation. Adv. Sci., 2018, Vol. 5, Iss. 5, 1700595. doi: 10.1002/advs.201700595.Ren C., Hu X., Zhou Q. Graphene Oxide Quantum Dots Reduce Oxidative Stress and Inhibit Neurotoxicity In Vitro and In Vivo through Catalase‐Like Activity and Metabolic Regulation. Advanced Science, 2018, Vol. 5, iss. 5, Article 1700595.Ruiz V., Yate L., García I., Cabanero G., Grande H.J. Tuning the antioxidant activity of graphene quantum dots: protective nanomaterials against dye decoloration. Carbon, 2017, Vol. 116, pp. 366-374.Ruiz V., Yate L., García I., Cabanero G., Grande H.J. Tuning the antioxidant activity of graphene quantum dots: Protective nanomaterials against dye decoloration. Carbon, 2017, Vol. 116, pp. 366-374.Tabish T.A., Zhang S., Winyard P.G. Developing the next generation of graphene-based platforms for cancer therapeutics: The potential role of reactive oxygen species. Redox Biol., 2018, Vol. 15, pp. 34-40.Tabish T.A., Zhang S., Winyard P.G. Developing the next generation of graphene-based platforms for cancer therapeutics: The potential role of reactive oxygen species. Redox biology, 2018, Vol. 15, pp. 34–40.Xu M., Zhu J., Wang F., Xiong Y., Wu Y., Wang Q., Weng J., Zhang Z., Chen W., Liu S. Improved in vitro and in vivo biocompatibility of graphene oxide through surface modification: poly (acrylic acid)-functionalization is superior to PEGylation. ACS Nano, 2016, Vol. 10, Iss. 3, pp. 3267-3281.Xu M., Zhu J., Wang F., Xiong Y., Wu Y., Wang Q., Weng J., Zhang Z., Chen W., Liu S. Improved In Vitro and In Vivo Biocompatibility of Graphene Oxide through Surface Modification: Poly(Acrylic Acid)-Functionalization is Superior to PEGylation. ACS Nano, 2016, Vol. 10, iss. 3, pp. 3267-3281.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.