mimmunМедицинская иммунологияMedical Immunology (Russia)1563-06252313-741XSPb RAACI10.15789/1563-0625-DOE-1906mimmun-1906Research ArticleКРАТКИЕ СООБЩЕНИЯSHORT COMMUNICATIONSРазработка иммуноферментного метода контроля качества вакцины на основе гибридного рекомбинантного белка P. aeruginosaDevelopment of ELISA test for the quality control of Pseudomonas aeruginosa recombinant vaccine based on the hybrid recombinant proteinСолдатенковаА. В.SoldatenkovaA. V.

Солдатенкова Алёна Владимировна – кандидат биологических наук,  старший научный сотрудник лаборатории протективных антигенов.

105064, Москва, Малый Казенный пер., 5а. Тел.: 8 (495) 916-25-87

Soldatenkova Alena Vladimirovna - PhD (Biology), Senior Research Associate, Laboratory of Protective Antigens.

105064, Moscow, Malyi Kazennyi lane, 5a, Phone: 7 (495) 916-25-87

sol.alena.v@yandex.ruКудряшоваА. М.KudryashovaA. M.

Кудряшова Александра Михайловна – научный сотрудник лаборатории медицинской  биотехнологии.

Kudryashova Alexandra Mikhailovna - Research Associate, Laboratory of Medical Biotechnology.

Moscow

2238250@rambler.ruГавриловаН. Ф.GavrilovaN. F.

Гаврилова Наталья Федоровна – кандидат химических наук, старший научный сотрудник лаборатории клеточных гибридов.

Москва

Gavrilova Natalia Fedorovna - PhD (Chemistry), Senior Research Associate, Laboratory of Cell Hybrids.

beresina54@mail.ruЯковлеваИ. В.YakovlevaI. V.

Яковлева Ирина Владимировна – кандидат биологических наук,  ведущий научный сотрудник лаборатории клеточных гибридов.

Москва

Yakovleva Irina Vladimirovna - PhD (Biology), Leading Senior Research Associate, Laboratory of Cell Hybrids.

Moscow

dissovet-mech@mail.ruБорисоваО. В.BorisovaO. V.

Борисова Ольга Васильевна – кандидат химических наук, заведующая  лабораторией медицинской  биотехнологии.

Borisova Olga Vasilievna - PhD (Chemistry), Head, Laboratory of Medical Biotechnology.

olvb@yandex.ruСвиридовВ. В.SviridovV. V.

Свиридов Валерий Васильевич – кандидат медицинских наук, заведующий  лабораторией клеточных гибридов.

Москва

Sviridov Valery Vasilievich - PhD (Medicine), Head, Laboratory of Cell Hybrids.

valery_sviridov@mail.ruМихайловаН. А.MikhailovaN. A.

Михайлова Наталья Александровна – доктор медицинских наук, профессор, заведующая лабораторией протективных антигенов.

Mikhailova Natalia Alexandrovna  - PhD, MD (Medicine), Professor, Head, Laboratory of Protective Antigens.

n_michailova@inbox.ruФГБНУ Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток имени И.И. МечниковаРоссияI. Mechnikov Research Institute of Vaccines and SeraRussian FederationФГБНУ Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток имени И.И. МечниковаРоссияMechnikov Research Institute of Vaccines and SeraRussian Federation202006082020224805810Copyright © Солдатенкова А.В., Кудряшова А.М., Гаврилова Н.Ф., Яковлева И.В., Борисова О.В., Свиридов В.В., Михайлова Н.А., 20202020Солдатенкова А.В., Кудряшова А.М., Гаврилова Н.Ф., Яковлева И.В., Борисова О.В., Свиридов В.В., Михайлова Н.А.Soldatenkova A.V., Kudryashova A.M., Gavrilova N.F., Yakovleva I.V., Borisova O.V., Sviridov V.V., Mikhailova N.A.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.mimmun.ru/mimmun/article/view/1906

Гибридный рекомбинантный белок  OprF-aTox-OprI, содержащий в своeм  составе аминокислотные последовательности трех наиболее значимых антигенов P. aeruginosа (мембранных белков OprF, OprI  и анатоксина aTox),  был включен в состав  вакцины против синегнойной инфекции. Контроль качества гибридного рекомбинантного белка  и вакцины на его основе предполагает определение его подлинности и полноты сорбции препарата на гидроксиде алюминия.

Цель исследования – разработка иммуноферментного метода  контроля качества вакцинного препарата на основе гибридного рекомбинантного белка  P. aeruginosа.

Гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела, специфичные к слитому рекомбинантному  белку, были  получены путем  слияния злокачественной линии миеломы мыши и  иммунных спленоцитов мышей, вакцинированных отдельными рекомбинантными белками синегнойной палочки. Для наработки антител в препаративных количествах гибридные клетки культивировали in vivo в мышах линии BALB/c. Супернатанты клеточных культур и асцитные жидкости хроматографически очищали на иммунном сорбенте. Конъюгирование антител с пероксидазой хрена проводили согласно методу Nakane P.K.  Гибридный рекомбинантный белок  OprF-aTox-OprI выявляли в твердофазном иммуноферментном анализе с использованием полученной панели моноклональных антител и конъюгатов  моноклональных антител с пероксидазой корня хрена,  специфичных к различным эпитопам белка.  В качестве калибровочных стандартов для построения калибровочного графика использовали разведения, содержащие от 78 нг/мл до 5000 нг/мл рекомбинантного белка  OprF-aTox-OprI.

Для детекции OprF-aTox-OprI апробированы 55 вариантов пар моноклональных антител, в 11 случаях показана способность выявлять рекомбинантный белок.  Критерием отбора  наиболее чувствительных и специфичных вариантов ИФА  служил  предел  количественного обнаружения. Для всех 11 вариантов теста  посчитан предел  количественного обнаружения. В результате проведенных исследований были  выбраны два варианта иммуноферментного анализа для контроля качества гибридного рекомбинантного белка, обладающие наибольшей чувствительностью. Первый вариант включал в себя  пару  моноклональных антител, специфичных к эпитопам OprF  и OprI, второй вариант – к эпитопам aTox и OprI.  Пределы количественного обнаружения составили 2,9 и 13,6 нг/мл (0,0058  и 0,027% от предполагаемого содержания антигена в вакцине) для первого и второго вариантов ИФА.

Отработаны два  варианта ИФА  для  выявления гибридного рекомбинантного белка  OprF-aToxOprI. Первый вариант позволяет определить количество белка и оценить полноту его сорбции на геле гидроокиси алюминия. Для подтверждения подлинности белка целесообразно применять оба метода, поскольку они позволяют доказать наличие всех трех антигенов (OprF, aTox и OprI), присутствующих в слитом белке.

A hybrid recombinant protein containing the amino  acid sequences of the three  most significant Pseudomonas aeruginosa antigens  (membrane proteins OprF, OprI  and toxoid  aTox)  was incorporated into a vaccine against Pseudomonas infection. Quality control of a hybrid recombinant protein and appropriate vaccine includes  determination of authentity and completeness of adsorption upon aluminum hydroxide adjuvant. The aim of our study was to develop  techniques of quality  control for a vaccine  based on the hybrid  OprF-aToxOprI  recombinant protein specific  to  P. aeruginosa.  Hybridomas secreting  specific  monoclonal antibodies for OprF-aTox-OprI were derived  from the fusion of myeloma cells and murine spleen  cells immunized with recombinant proteins P. aeruginosa. To  produce sufficient  quantities of antibodies, the  hybrid  cells were in vivo cultured in BALB/c mice.  Supernates and ascite liquids were chromatographically purified  with immune sorbent. Conjugation of antibodies with  horseradish peroxidase was carried  out  according to  P.K.Nakane. The  hybrid  OprF-aTox-OprI recombinant protein was detected by the  solid-phase ELISA, using a panel  of monoclonal antibodies and  conjugates of monoclonal antibodies with  horseradish peroxidase. Monoclonal antibodies were specific for different  OprF-aTox-OprI epitopes. Titration assays containing OprF-aTox-OprI protein at 78 ng/ml to 5000 ng/ml were used as quantitative standards for calibration curves.

To identify  the recombinant protein OprF-aTox-OprI, 55 variants  of of MAb pairs were tested.  Limits  of quantitative detection served  for selection of most  sensitive  and  specific  ELISA  variants.  The  quantitative detection limit was calculated for all 11 ELISA  variants.  Two ELISA  variants  with the highest  sensitivity were selected  for  quality  control of the  hybrid  recombinant protein. The  limits  of quantitative detection were, respectively, 2.9 and 13.6 ng/ml (0.0058  and 0.027% of the estimated antigen  content in the vaccine)  for the first and  second  ELISA  variants.  The  first variant  included a pair  of monoclonal antibodies specific  for the OprF  and OprI  epitopes, the second  variant  represented aTox and OprI  epitopes. Two variants  of ELISA  were developed to detect  the hybrid recombinant OprF-aTox-OprI protein. The first variant allows to determine the protein amount and to evaluate completeness of its adsorption on aluminum hydroxide. To confirm authenticity of the protein, both methods must be used, since they can detect all three antigens (OprF, aTox and OprI) which are present  in the fusion protein.

акцинаPseudomonas aeruginosaгибридный рекомбинантный белок OprF-aTox-OprIиммуноферментный анализvaccineP. aeruginosahybrid recombinant proteinOprF-aTox-OprIenzyme-linked immunoassayReferencesБлаговидов Д.А., Костинов М.П., Симонова О.И., Шмитько А.Д., Буркина Н.И., Шахназарян М.К. Переносимость вакцины против P. aeruginosa у детей с муковисцидозом и врожденными пороками развития легких // Эпидемиология и вакцинопрофилактика, 2016. Т. 15, № 2 (87), С. 55-66.Blagovidov D.A., Kostinov M.P., Simonova O.I., Shmitko A.D., Burkina N.I., Shahnazaryan M.K. The tolerability of the vaccine against P. aeruginosa in children with cystic fibrosis and congenital lung development. Epidemiologiya i vaktsinoprofilaktika = Epidemiology and Vaccinal Prevention, 2016, Vol. 15, no. 2 (87), pp. 55-66. (In Russ.)Калошин А.А., Леонова Е.И., Солдатенкова А.В., Михайлова Н.А. Исследование протективных свойств рекомбинантного комплекса белка F наружной мембраны и анатоксина Pseudomonas aeruginosa // Вестник Российской академии медицинских наук, 2016, Т. 71, № 1. С. 5-10.Kaloshin A.A., Leonova E.I., Soldatenkova A.V. Assessment of protective properties of the recombinant complex of the outer membrane protein F and the toxoid of Pseudomonas aeruginosa. Vestnik Rossiyskoy akademii meditsinskikh nauk = Annals of the Russian Academy of Medical Sciences, 2016, Vol. 71, no. 1, pp. 5-10. (In Russ.)Лазарева А.В., Чеботарь И.В., Крыжановская О.А., Чеботарь В.И., Маянский Н.А. Pseudomonas aeruginosa: патогенность, патогенез и патология // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия, 2015. Т. 17, № 3. С. 170-186.Lazareva A.V., Tchebotar I.V., Kryzhanovskaya O.A., Tchebotar V.I., Mayanskiy N.A. Pseudomonas aeruginosa: pathogenicity, pathogenesis and diseases. Klinicheskaya mikrobiologiya i antimikrobnaya khimioterapiya= Clinical Microbiology and Antimicrobial Chemotherapy, 2015, Vol. 17, no. 3, pp. 170-186. (In Russ.)Михайлова Н.А., Зимина Е.М., Солдатенкова А.В., Калошин А.А. Разработка вакцины на основе рекомбинантных антигенов синегнойной палочки // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии, 2019. № 1. С. 74-80.Mihailova N.A., Zimina E.M., Soldatenkova A.V., Kaloshin A.A. Development of the vaccine based on the recombinant antigens of Pseudomonas aeruginosa. Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii i immunobiologii = Journal of Microbiology, Epidemiology and Immunobiology, 2019, no. 1, pp. 74-80. (In Russ.)Патент РФ № 2677790 С1, 2017.09.22. – Калошин А.А., Зимина Е.М., Михайлова Н.А. Рекомбинантная плазмидная ДНК pPA-OPRF-ATOX-OPRI, кодирующая синтез гибридного рекомбинантного белка, включающего аминокислотные последовательности белков F и I наружной мембраны и атоксического варианта экзотоксина А Pseudomonas aeruginosa, штамм Escherichia coli PA-OPRF-ATOX-OPRI – продуцент гибридного рекомбинантного белка, и способ получения указанного белка.RU patent No. 2677790 C1, 2017.09.22 – Kaloshin A.A., Zimina E.M., Mikhailova N.A. Recombinant plasmid DNA pPA-OPRF-ATOX-OPRI, encoding the synthesis of a hybrid recombinant protein, including the amino acid sequences of the outer membrane F and I proteins and the atoxic variant of exotoxin A Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli strain PA-OPRF-ATOXOPRI – producer recombinant protein recombinant and method for producing said protein.Солдатенкова А.В., Зимина Е.М., Кудряшова А.М., Гаврилова Н.Ф., Яковлева И.В., Борисова О.В., Свиридов В.В., Михайлова Н.А. Разработка иммуноферментных методов оценки контроля качества рекомбинантной вакцины синегнойной // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии, 2019. № 1. С. 95-100.Soldatenkova A.V., Zimina E.M., Kudryashova A.M., Gavrilova N.F., Yakovleva I.V., O.V. Borisova, V.V. Sviridov, N.A. Mikhailova. Development of ELISAs for the quality control of a recombinant pseudomonas vaccine. Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii i immunobiologii = Journal of Microbiology, Epidemiology and Immunobiology, 2019, no. 1, pp. 95-100. (In Russ.)Doring G., Meisner C., Stern М. A double-blind randomized placebo-controlled phase III study of a Pseudomonas aeruginosa flagella vaccine in cystic fibrosis patients. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2007, Vol. 104, no. 26, pp. 11020-11025.Doring G., Meisner C., Stern М. A double-blind randomized placebo-controlled phase III study of a Pseudomonas aeruginosa flagella vaccine in cystic fibrosis patients. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2007, Vol. 104, no. 26, pp. 11020-11025.Farajnia S., Peerayeh S.N., Tanomand A., Majidi J., Goudarzi G., Naghili B., Rahbarnia L. Protective efficacy of recombinant exotoxin A – flagellin fusion protein against Pseudomonas aeruginosa infection. Can. J. Microbiol., 2015, Vol. 61, no. 1, pp. 60-64.Farajnia S., Peerayeh S.N., Tanomand A., Majidi J., Goudarzi G., Naghili B., Rahbarnia L. Protective efficacy of recombinant exotoxin A – flagellin fusion protein against Pseudomonas aeruginosa infection. Can. J. Microbiol., 2015, Vol. 61, no. 1, pp. 60-64.Zuercher A.W., Imboden M.A., Jampen S., Bosse D., Ulrich M., Chtioui H., Lauterburg B.H., Lang A.B. Cellular immunity in healthy volunteers treated with an octavalent conjugate Pseudomonas aeruginosa vaccine. Clin. Exp. Immunol., 2006, Vol. 143, no. 1, pp. 132-138.Zuercher A.W., Imboden M.A., Jampen S., Bosse D., Ulrich M., Chtioui H., Lauterburg B.H., Lang A.B. Cellular immunity in healthy volunteers treated with an octavalent conjugate Pseudomonas aeruginosa vaccine. Clin. Exp. Immunol., 2006, Vol. 143, no. 1, pp. 132-138.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.