Кудряшова А.М. – научный сотрудник лаборатории медицинской биотехнологии
115088, Москва, ул. 1-я Дубровская, 15
Kudryashova A.M., Research Associate, Laboratory of Medical Biotechnology
115088, Moscow, 1st Dubrovskaya str., 15.
Нестеренко Л.Н. – к.х.н., ведущий научный сотрудник лаборатории клонирования вирусных геномов
115088, Москва, ул. 1-я Дубровская, 15
Nesterenko L.N., PhD (Сhemistry), Leading Research Associate, Viral Genome Cloning Laboratory
115088, Moscow, 1st Dubrovskaya str., 15.
Генералова Г.А. – педиатр-нефролог
Москва
Generalova G.A., Pediatrician-Nephrologist
Moscow
Абасеева Т.Ю. – педиатр-нефролог
Москва
Abaseeva T.Yu., Pediatrician-Nephrologist
Moscow
Михайлова Н.А. – д.м.н., профессор, заведующая лабораторией протективных антигенов
115088, Москва, ул. 1-я Дубровская, 15
Mikhailova N.A., PhD, MD (Medicine), Professor, Head, Laboratory of Protective Antigens
115088, Moscow, 1st Dubrovskaya str., 15.
Борисова О.В. – к.х.н., заведующая лабораторией медицинской биотехнологии
115088, Москва, ул. 1-я Дубровская, 15
Borisova O.V., PhD (Сhemistry), Head, Laboratory of Medical Biotechnology
115088, Moscow, 1st Dubrovskaya str., 15.
Целью исследования является характеристика антител к эритропоэтину в сыворотках крови пациентов, проходящих терапию препаратами эритропоэтина. Проанализированы 106 сывороток крови пациентов, получавших препараты эритропоэтина. Для сравнительного анализа были исследованы 134 сыворотки пациентов, не получавших препараты ЭПО. Исследование проводили методом твердофазного ИФА при пассивной иммобилизации рчЭПО и иммунохимической через стептавидин-биотиновое взаимодействие. Выявление антител к эритропоэтину проводили с использованием мышиных моноклональных антител к IgG, IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4 человека, конъюгированных с пероксидазой хрена, а при количественном определении – конъюгата протеина-А с пероксидазой. В качестве калибровочного стандарта применяли поликлональные антитела кролика к ЭПО человека с известной концентрацией. Для построения калибровочного графика были выбраны шесть калибровочных образцов в диапазоне концентрацией 16-1000 нг/мл. Предел обнаружения составил 12 нг/мл, а предел количественного обнаружения – 31 нг/мл. При иммунохимической иммобилизации частота выявления суммарных IgG-антител увеличилась в 3,2 раза, IgG1 – в 1,1 раз, IgG2 – в 1,25 раза, IgG3 – в 1,5 раза, IgG4 – в 1,7 раза. У большинства пациентов были обнаружены антитела со смешанным изотипом, в 3-х образцах были детектированы только IgG1- или IgG4-антитела к ЭПО. В выборке из 106 образцов IgМ-антитела не определялись, суммарные IgG-антитела были выявлены в 36,8% случаев, в 34% образцов их наличие было подтверждено выявлением антител хотя бы одного из подклассов. IgG1-антитела были выявлены в 83,3%, IgG4 – в 80,6% образцов, в которых присутствовали суммарные IgG-антитела. Во всех случаях антитела IgG2 и/или IgG3 подклассов были обнаружены в присутствии IgG1- или IgG4-антител. Концентрация антител составила 3,2-35,5 мкг/мл у 28 пациентов, у 8 пациентов уровень антител был более 50 мкг/мл, у 3-х находился ниже предела количественного обнаружения. Только в 6 образцах были выявлены антитела с индексом авидности более 50%. Иммунохимическая иммобилизация антигена привела к повышению чувствительности при определении специфических антител всех подклассов. IgG-антитела были выявлены более чем в трети сывороток крови пациентов, получавших препараты ЭПО, преимущественно определялись низкоавидные антитела IgG1- и IgG4-подклассов.
Our aim was to characterize anti-EPO antibodies in serum samples of the patients treated with erythropoietin. 106 serum samples from the patients treated with erythropoietin (EPO) were collected and assayed. 134 serum samples of patients who did not receive EPO were taken for comparative analysis. The anti-EPO antibody detection was performed in ELISA test with rhEPO, by passive capture on ELISA plates, using steptavidin-biotin immunochemical system. Mouse monoclonal antibodies to human IgG, IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4 conjugated to horseradish peroxidase were used to detect anti-EPO antibodies, and protein-A peroxidase conjugate was used for quantitative assays. Rabbit anti-human EPO polyclonal antibodies at known concentrations were used as a calibration standard. Six calibration samples at the concentration range of 16-1000 ng/ml were used to plot calibration curves. The lower detection limit was 12 ng/mL, and the quantitative detection limit was 31 ng/ml. Immunochemical capturing led to increasing of total IgG antibody detection by 3.2 times, IgG1 – by 1.1 times IgG2 – by 1.25 times, IgG3 – by 1.5 times, IgG4 – by 1.7 times. Antibodies of mixed isotype were found in most patients. IgG1 or IgG4 antibodies to EPO were determined only in 3 samples. Specific IgM was not detectable among 106 sera samples, whereas total IgG antibodies were detected in 36.8 % of cases. In 34% of sera, their presence was confirmed by detection of at least one of the subclasses. IgG1 antibody was detected in 83.3%; IgG4, in 80.6% of the samples positive for total IgG antibodies. In all cases, IgG2 and/or IgG3 were detected in presence of IgG1 or IgG4 antibodies. The antibody concentration was 3.2 to 35.5 µg/mL in sera from 28 patients, in 8 cases the level of antibodies was > 50 µg/ml, however, being below the limit of quantitative detection in 3 patients. Only 6 samples contained antibodies with avidity index of > 50%. Immunochemical capturing of the antigen led to increased sensitivity for detecting all subclasses of specific antibodies. The specific IgG antibodies to EPO were found in more than 1/3 of serum samples from the patients treated with erythropoietin. Low-avidity antibodies of IgG1 and IgG4 subclasses were determined in most cases.
The authors declare that there are no conflicts of interest present.