mimmunМедицинская иммунологияMedical Immunology (Russia)1563-06252313-741XSPb RAACI10.15789/1563-0625-EOV-1869mimmun-1869Research ArticleОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИORIGINAL ARTICLESВлияние вирулентных и вакцинных вариантов вируса гриппа на иммунофенотип дендритных клеток, генерированных из костного мозга мышейEffect of virulent and vaccine variants of influenza virus on the immunophenotype of dendritic cells generated from murine bone marrowhttps://orcid.org/0000-0002-4212-0276АхматоваН. К.AkhmatovaN. K.

Ахматова Нэлли Кимовна, д.м.н., заведующая лабораторией механизмов регуляции иммунитета

115404, Москва, ул. Бирюлевская, 1, корп. 3, кв. 25Тел.: 8 (919) 776-55-70 

Akhmatova Nelli K., PhD, MD (Medicine), Head, Laboratory of Immunity Regulation Mechanisms

115404, Moscow, Birulevskaya str., 1, bldg 3, apt 25.Phone: 7 (919) 776-55-70

anelly@mail.ruРтищевА. А.RtishchevA. A.

младший научный сотрудник лаборатории генетики РНК-содержащих вирусов

Москва

Junior Research Associate, RNA Virus Genetics Laboratory

Moscow

МаркушинС. Г.MarkushinS. G.

д.б.н., заведующий лабораторией генетики РНК-содержащих вирусов

Москва

PhD, MD (Biology), Head, RNA Virus Genetics Laboratory

Moscow

КостиноваА. М.KostinovaA. M.

младший научный сотрудник лаборатории механизмов регуляции иммунитета

Москва

Junior Research Associate, Laboratory of Immunity Regulation Mechanisms

Moscow

АхматоваЭ. А.AkhmatovaE. A.

младший научный сотрудник лаборатории механизмов регуляции иммунитета

Москва

Junior Research Associate, Laboratory of Immunity Regulation Mechanisms

Moscow

СтолпниковаВ. Н.StolpnikovaV. N.

к.б.н., старший научный сотрудник лаборатории механизмов регуляции иммунитета

Москва

PhD (Biology), Senior Research Associate, Laboratory of Immunity Regulation Mechanisms

Moscow

КалиниченкоЕ. О.KalinichenkoE. O.

младший научный сотрудник лаборатории механизмов регуляции иммунитета

Москва

Junior Research Associate, Laboratory of Immunity Regulation Mechanisms

Moscow

ШубинаИ. Ж.ShubinaI. Zh.

д.б.н., ведущий научный сотрудник лаборатории клеточного иммунитета

Москва

PhD, MD (Biology), Leading Reseach Associate, Laboratory of Cellular Immunity

Moscow

БишеваИ. В.BishevaI. A.

младший научный сотрудник лаборатории механизмов регуляции иммунитета

Москва

Junior Research Associate, Laboratory of Immunity Regulation Mechanisms

Moscow

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток имени И.И. Мечникова»РоссияI. Mechnikov Research Institute of Vaccines and SeraRussian FederationФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии имени Н.Н. Блохина»РоссияN. Blokhin National Medical Research Center of OncologyRussian Federation202020052020223473482Copyright © Ахматова Н.К., Ртищев А.А., Маркушин С.Г., Костинова А.М., Ахматова Э.А., Столпникова В.Н., Калиниченко Е.О., Шубина И.Ж., Бишева И.В., 20202020Ахматова Н.К., Ртищев А.А., Маркушин С.Г., Костинова А.М., Ахматова Э.А., Столпникова В.Н., Калиниченко Е.О., Шубина И.Ж., Бишева И.В.Akhmatova N.K., Rtishchev A.A., Markushin S.G., Kostinova A.M., Akhmatova E.A., Stolpnikova V.N., Kalinichenko E.O., Shubina I.Z., Bisheva I.A.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.mimmun.ru/mimmun/article/view/1869

Цель исследования – генерация дендритных клеток из костного мозга мышей (ДК) in vitro и оценка влияния вирулентных и аттенуированных вариантов вируса гриппа на созревание ДК.

Для индукции дифференцировки мононуклеаров костного мозга в ДК использовали гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF) и интерлейкин-4 (IL-4). На 5 сутки инкубации добавляли штаммы вируса гриппа в культуру ДК и дополнительно инкубировали их в течение 2 дней. Оценивали морфологические характеристики ДК, иммунофенотип и экспрессию некоторых Toll-подобных рецепторов (TLR).

На пятый день инкубации ДК приобретали типичные морфологические характеристики. ДК имели большие размеры с эксцентрично расположенным ядром, чаще неправильной формы, многочисленными отростками. На 7 день инкубации в присутствии штаммов вируса гриппа цитоплазма их несколько уплотнялась, ДК приобретали больше отростков, необходимых для межклеточных контактов. В зрелых ДК был повышен уровень экспрессии маркера CD11c, костимуляторных молекул CD80, CD86, CD83 и молекул МНС II. Вирулентные и аттенуированные штаммы вируса гриппа индуцировали различные варианты дифференцировки ДК, включая формирование поверхностных маркеров дифференциации на мембране клеток, экспрессию Toll-подобных рецепторов и костимулирующих молекул.

Мышиные мононуклеары костного мозга могут продуцировать большое количество н-ДК, которые могут созревать в присутствии различных вариантов вируса гриппа. При формировании иммунофенотипа ДК под влиянием исследуемых вариантов вируса гриппа обнаружено в разной степени проявление признаков иммуносупрессии. Аттенуированные варианты U-2 и M-26, полученные с помощью сайт-специфического мутагенеза, при формировании иммунофенотипа ДК обладали сниженной иммуносупресирующей активностью и не уступали холодоадаптированному (ХА) реассортанту по большинству позиций, а по некоторым позициям превосходили его. Данные исследования могут помочь выявить критерии оценки эффективности разрабатываемых вакцин против гриппа in vitro.

The aim of this study was to generate dendritic cells from the bone marrow of mice (DC) in vitro and to assess the effect of virulent and attenuated variants of influenza virus on the maturation of DCs. Granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) and interleukin-4 (IL-4) were used in combination, to induce differentiation of mouse bone marrow (BM) mononucleocytes into DCs. On the 5th day, distinct variants of influenza virus were added to the cell culture, and the cells were additionally incubated for 2 days. The morphological characteristics of DCs, immunophenotype of DCs and expression of some Toll-like receptors were evaluated. On the 5th day of incubation. the DCs acquired typical morphological characteristics. DCs were large in size with an eccentrically located nucleous, often irregular in shape, with numerous processes. On the 7th day of incubation with influenza virus variants, their cytoplasm was somewhat denser. DCs acquired more processes, necessary for intercellular contacts. Expression levels of CD11c, a specific marker of BM-derived DCs, and of co-stimulatory molecules such as CD40, CD80, CD86, and MHC-II were elevated in mature DCs. Virulent versus attenuated strains of the influenza virus induced special variants of DCs differentiation, with respect to expression rates of differentiation markers, as well as expression of Toll-like receptors and costimulatory molecules. Conclusions. The in vitro cultured murine mononucleocytes derived from bone marrow can produce a large number of n-DCs, that can mature in the presence of different variants.

During evolution of the DC immunophenotype treated with variant influenza viruses, we have found distinct signs of immunosuppression.

The attenuated U-2 and M-26 influenza variants obtained by site-specific mutagenesis upon development of DCs immunophenotype, exhibited a decreased immunosuppressive activity and were not inferior to the cold-adapted (CA) reassortant for the most positions, but exceeded it in some instances. These studies can help to assess the criteria for evaluation the efficiency of in vitro developed influenza vaccines.

культура клетокдендритные клеткиморфологиявирулентные и аттенуированные варианты вируса гриппамаркеры дифференцировкикостимуляторные молекулыToll-подобные рецепторыcell culturedendritic cellsmorphologyinfluenza virusvirulent and attenuated variantsdifferentiation markersToll-like receptorsReferencesАхматова Н.К., Маркушин С.Г., Кривцов Г.Г., Акопова И.И., Коптяева И.Б. Сравнительное изучение адъювантных свойств препаратов хитозана при парентеральной иммунизации инактивированной гриппозной вакциной // Эпидемиология и вакцинопрофилактика, 2011. № 3. С. 42-53.Akhmatova N.K., Markushin S.G., Krivtsov G.G., Akopova I.I., Koptyaeva I.B. A comparative study of the adjuvant properties of chitosan preparations during parenteral immunization with an inactivated influenza vaccine. Epidemiologiya i vaktsinoprofilaktika = Epidemiology and Vaccine Prevention, 2011, no. 3, pp. 42-53. (In Russ.)Кост В.Ю., Ртищев А.А., Минтаев Р.Р., Акопова И.И., Лисовская К.В., Маркушин С.Г. Изучение биологических свойств аттенуированных вариантов штамма А/WSN/33 вируса гриппа, полученных с помощью сайт-специфического мутагенеза РВ2-гена // Журнал микробиологии, эпидемиологии, иммунобиологии, 2019. № 2. С. 68-76.Kost V.Yu., Rtischev A.A., Mintaev R.R., Akopova I.I., Lisovskaya K.V., Markushin S.G. Study of the biological properties of attenuated variants of strain A/WSN/33 of the influenza virus obtained using site-specific mutagenesis of the PB2 gene. Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii, immunobiologii = Journal of Microbiology, Epidemiology, Immunobiology 2019, no. 2, pp. 68-76. (In Russ.)Маркушин С.Г., Гендон Ю.З., Кривцов Г.Г., Акопова И.И., Сухно А.С., Переверзев А.Д. Повышение иммуногенности живой холодоадаптированной гриппозной вакцины с помощью адъюванта // Журнал микробиологии, эпидемиологии, иммунобиологии, 2010. № 5. С. 29-34.Markushin S.G., Gendon Yu.Z., Krivtsov G.G. , Akopova I. I. , Sukhno A.S., Pereverzev A.D. Increasing the immunogenicity of a living cold-adapted influenza vaccine using an adjuvant. Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii, immunobiologii = Journal of Microbiology, Epidemiology, Immunobiology, 2010, no. 5, pp. 29-34. (In Russ.)Bicback K., Breer C., Nanan R., Ter Meulen V., Schneider-Schulies S. Expansion of human gamma/delta T cells in vitro is different ially regulated by the measles virus glycoproteins. J. Gen Virol., 2003, Vol. 84, no. 5, pp. 1179-1188.Bicback K., Breer C., Nanan R., Ter Meulen V., Schneider-Schulies S. Expansion of human gamma/delta T cells in vitro is different ially regulated by the measles virus glycoproteins. J. Gen Virol., 2003, Vol. 84, no. 5, pp. 1179-1188.Dalod M., Chelbi R., Malissen B., Lawrence T. Dendritic cell maturation: functional specialization through signaling specificity atranscriptional programming. EMBO J., 2014, Vol. 33, no. 10, pp. 1104-1116.Dalod M., Chelbi R., Malissen B., Lawrence T. Dendritic cell maturation: functional specialization through signaling specificity atranscriptional programming. EMBO J., 2014, Vol. 33, no. 10, pp. 1104-1116.Dowling J.K., Mansell A. Toll-like receptors: the swiss army knife of immunity and vaccine development. Clin. Transl. Immunology, 2016, Vol. 5, no. 5, e85. doi: 10.1038/cti.2016.22.Dowling J.K., Mansell A. Toll-like receptors: the swiss army knife of immunity and vaccine development. Clin. Transl. Immunology, 2016, Vol. 5, no. 5, e85. doi: 10.1038/cti.2016.22.Jiang P.L., Lin H.J., Wang H.W., Tsai W.Y., Lin S.F., Chien M.Y., Liang P.H., Huang Y.Y., Liu D.Z. Galactosylated liposome as a dendritic cell-targeted mucosal vaccine for inducing protective anti-tumor immunity. Acta Biomater., 2015, Vol. 11, pp. 356-367.Jiang P.L., Lin H.J., Wang H.W., Tsai W.Y., Lin S.F., Chien M.Y., Liang P.H., Huang Y.Y., Liu D.Z. Galactosylated liposome as a dendritic cell-targeted mucosal vaccine for inducing protective anti-tumor immunity. Acta Biomater., 2015, Vol. 11, pp. 356-367.Kawai T., Akira S. The role of pattern-recognition receptors in innate immunity: update on Toll-like receptors. Nat. Immunol., 2010, Vol. 11, pp. 373-384.Kawai T., Akira S. The role of pattern-recognition receptors in innate immunity: update on Toll-like receptors. Nat. Immunol., 2010, Vol. 11, pp. 373-384.Kost V.Y., Koptyaeva I.B., Akopova I.I., Tsfasman T.M., Rtishchev A.A., Lisovskaya A.V., Markushin S.G. Investigation of efficiency of site-specific mutants of the influenza virus in homological and heterological control infection. ECronicon Microbiology J., 2017, Vol. 12, no. 5, pp. 232-242.Kost V.Y., Koptyaeva I.B., Akopova I.I., Tsfasman T.M., Rtishchev A.A., Lisovskaya A.V., Markushin S.G. Investigation of efficiency of site-specific mutants of the influenza virus in homological and heterological control infection. ECronicon Microbiology J., 2017, Vol. 12, no. 5, pp. 232-242.Lin W., Chen Y.L., Jiang L., Chen J.K. Reduced expression of chemerin is associated with a poor prognosis and a lowed infiltration of both dendritic cells and natural killer cells in human hepatocellular carcinoma. Clin. Lab., 2011, Vol. 57, pp. 879-885.Lin W., Chen Y.L., Jiang L., Chen J.K. Reduced expression of chemerin is associated with a poor prognosis and a lowed infiltration of both dendritic cells and natural killer cells in human hepatocellular carcinoma. Clin. Lab., 2011, Vol. 57, pp. 879-885.Paul W.E. Fundamental Immunology, 6 th edition. Philadelphia: Wolters Kluwer/Lippincott Williams & Wilkins, 2008. 1603 p.Paul W.E. Fundamental Immunology, 6 th edition. Philadelphia: Wolters Kluwer/Lippincott Williams & Wilkins, 2008. 1603 p.Polezhaev F.I. Conditions for production of thermosensitive attenuated influenza virus recombinants. Acta Virologica, 1978, Vol. 22, pp. 263-269.Polezhaev F.I. Conditions for production of thermosensitive attenuated influenza virus recombinants. Acta Virologica, 1978, Vol. 22, pp. 263-269.Rosalia R.A., Cruz L.J., van Duikeren S., Tromp A.T., Silva A.L., Jiskoot W., de Gruijl T., Löwik C., Oostendorp J., van der Burg S.H., Ossendorp F. CD40-targeted dendritic cell delivery of PLGA-nanoparticle vaccines induce potent anti-tumor responses. Biomaterials, 2015, Vol. 40, pp. 88-97.Rosalia R.A., Cruz L.J., van Duikeren S., Tromp A.T., Silva A.L., Jiskoot W., de Gruijl T., Löwik C., Oostendorp J., van der Burg S.H., Ossendorp F. CD40-targeted dendritic cell delivery of PLGA-nanoparticle vaccines induce potent anti-tumor responses. Biomaterials, 2015, Vol. 40, pp. 88-97.Wang H.L., Xu H., Lu W.H., Zhu L., Yu Y.H., Hong F.Z. In vitro and in vivo evaluations of human papillomavirus type 16 (HPV16)-derived peptide-loaded dendritic cells (DCs) with a CpG oligodeoxynucleotide (CpG-ODN) adjuvant as tumor vaccines for immunotherapy of cervical cancer. Arch. Ginecol. Obstet., 2014. Vol. 289, pp. 155-162.Wang H.L., Xu H., Lu W.H., Zhu L., Yu Y.H., Hong F.Z. In vitro and in vivo evaluations of human papillomavirus type 16 (HPV16)-derived peptide-loaded dendritic cells (DCs) with a CpG oligodeoxynucleotide (CpG-ODN) adjuvant as tumor vaccines for immunotherapy of cervical cancer. Arch. Ginecol. Obstet., 2014. Vol. 289, pp. 155-162.Wang W., Li J., Wu K., Azhati B., Rexiati M. Culture and identification of mouse bone marrow-derived dendritic cells and their capability to induce T-lymphocyte proliferation. Med. Sci. Monit., 2016, Vol. 22, pp. 244-250.Wang W., Li J., Wu K., Azhati B., Rexiati M. Culture and identification of mouse bone marrow-derived dendritic cells and their capability to induce T-lymphocyte proliferation. Med. Sci. Monit., 2016, Vol. 22, pp. 244-250.Zheng C., Yu G., Wang H., Tang A., Geng P., Zhang H., Zhu Z., Li F., Xie X. Meta-analysis of chemotherapy and dendritic cells with cytokine-induced killer cells in the treatment of non-small-cell lung cancer. Int. J. Clin. Exp. Med., 2015, Vol. 8, pp. 14527-14537.Zheng C., Yu G., Wang H., Tang A., Geng P., Zhang H., Zhu Z., Li F., Xie X. Meta-analysis of chemotherapy and dendritic cells with cytokine-induced killer cells in the treatment of non-small-cell lung cancer. Int. J. Clin. Exp. Med., 2015, Vol. 8, pp. 14527-14537.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.