mimmunМедицинская иммунологияMedical Immunology (Russia)1563-06252313-741XSPb RAACI10.15789/1563-0625-2018-6-935-942mimmun-1682Research ArticleИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫIMMUNOLOGICAL METHODSСРАВНЕНИЕ ИФА С ХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНТНОЙ И КОЛОРИМЕТРИЧЕСКОЙ ДЕТЕКЦИЕЙ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ СПЕЦИФИЧЕСКИХ IgG-АНТИТЕЛ К ЭРИТРОПОЭТИНУ ЧЕЛОВЕКА В СЫВОРОТКАХ КРОВИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХCOMPARISON OF COLORIMETRIC AND CHEMILUMINESCENT ELISA TESTS FOR DETECTION OF IgG ANTIBODIES TO HUMAN EPO IN THE SERA OF EXPERIMENTAL ANIMALSКудряшоваА. М.KudryashovaA. M.

младший научный сотрудник лаборатории медицинской биотехнологии

115088, Россия, Москва, ул. 1-я Дубровская, 15.Тел.: 8 (495) 674-54-97

Junior Research Associate, Laboratory of Biotechnology

115088, Russian Federation, Moscow, 1st Dubrovskaya str., 15.Phone: 7 (495) 674-54-97

2238250@rambler.ruМихайловаН. А.MikhailovaN. A.

д.м.н., профессор, заместитель директора по науке

PhD, MD (Medicine), Professor, Deputy Director,

БорисоваО. В.BorisovaO. V.

к.х.н., заведующая лабораторией медицинской биотехнологии

PhD (Chemistry), Head, Laboratoryof Biotechnology

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток имени И.И. Мечникова»РоссияI. Mechnikov Research Institute of Vaccines and SeraRussian Federation201815122018206935942Copyright © Кудряшова А.М., Михайлова Н.А., Борисова О.В., 20182018Кудряшова А.М., Михайлова Н.А., Борисова О.В.Kudryashova A.M., Mikhailova N.A., Borisova O.V.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.mimmun.ru/mimmun/article/view/1682

Серьезной проблемой терапии препаратами рекомбинантного человеческого эритропоэтина является выработка антител к эритропоэтинстимулирующим препаратам, приводящая к изменению фармакокинетического профиля и снижению эффективности терапии. При длительном лечении препаратами эритропоэтина в редких случаях может происходить выработка нейтрализующих антител, приводящих к полной аплазии красного костного мозга. Определение антител к терапевтическим препаратам эритропоэтина является важным этапом оценки их иммуногенности на этапах доклинических и клинических исследований, а также в ходе терапии препаратами эритропоэтина. Проведено сравнение методов выявления специфических IgG-антител к эритропоэтину человека твердофазным иммуноферментным методом с применением колориметрической и хемилюминесцентной детекции, в системах 3,3’,5,5’-тетраметилбензидин – пероксид водорода и люминол – пероксид водорода соответственно. Выявление антител проводили в сыворотках крови экспериментальных животных – кроликов и морских свинок – полученных после введения животным разных доз препаратов пегилированного человеческого рекомбинантного эритропоэтинабета подкожно или внутривенно. В качестве контроля использовали аффинно очищенные поликлональные антитела кролика к эритропоэтину человека. Исследовано влияние концентрации перекиси водорода и люминола на чувствительность хемилюминесцентного метода. Показано, что при использовании для усиления хемилюминесценции 4-йодофенола наблюдается повышение чувствительности в 1,5-2 раза. Сравнение интенсивности хемилюминесценции во времени показало большую стабильность во времени для субстратной смеси, приготовленной на боратном буфере. Снижение хемилюминесцентного сигнала во времени было пропорционально снижению фонового сигнала, что делало соотношение сигнал/фон стабильным в течение 3-30 мин. В результате оптимизации состава субстратной смеси и условий проведения регистрации интенсивности хемилюминесценции минимальное количество аффинно очищенных поликлональных антител кролика к эритропоэтину человека, выявленных в методе с хемилюминесцентной детекцией, составило 0,08 нг/мл, а с колориметрической детекцией – 0,6 нг/мл. Диапазон измерений при этом был расширен более чем в 20 раз. При выявлении специфических IgG антител к эритропоэтину человека в сыворотках крови экспериментальных животных методом с хемилюминесцентной детекцией показано увеличение чувствительности, определяемое путем сравнения индексов позитивности анализируемых образцов, в 1,9-2,6 раза в сыворотках кроликов и в 1,8-8,9 раза в сыворотках морских свинок. Выявлена корреляция при количественном определении антител в сыворотках кроликов двумя методами (R = 0,981). Таким образом, хемилюминесцентный метод детекции позволил повысить чувствительность выявления IgG-антител к эритропоэтину человека твердофазным иммуноферментным методом.

Production of antibodies to erythropoietin-stimulating drugs is an important problem of therapy with recombinant human erythropoietin (EPO). It leads to changes in the pharmacokinetic profile and decreased therapeutic efficiency. Upon long-term treatment with EPO preparations, neutralizing antibodies can result in rare cases, thus leading to complete pure red cell aplasia. Hence, detection of antibodies to EPO is an important stage in the assessment of the drug immunogenicity in preclinical and clinical studies, as well as during the treatment with EPO. We have compared colorimetric and chemiluminescent ELISA tests for detection of IgG antibodies to human EPO with 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine – hydrogen peroxide and luminol -hydrogen peroxide detection systems, respectively. Аntibodies to human EPO were determined in blood serum samples of experimental animals, i.e., rabbits and guinea pigs following their immunization withdifferent doses of pegylated human recombinant EPO-beta subcutaneously or intravenously. The affinitypurified rabbit polyclonal antibodies to human EPO were used as a reference material. The effects of hydrogen peroxide and luminol concentrations upon sensitivity of a chemiluminescent method were also studied. We have shown a 1.5-2-fold increase in sensitivity when using 4-iodophenol for amplification of chemiluminescence. A comparison of the chemiluminescence intensity with time has demonstrated a better stability for the substrate mixture prepared on borate buffer. A decrease in chemiluminescence signal with time was proportional to the decrease in background signal, thus rendering stability of the signal/background ratio for 3 to 30 minutes. Due to optimizing the substrate mixture composition and conditions of chemiluminescence recording, the reached detection limits for colorimetric and chemiluminescent ELISA’s were, respectively, 0.6 ng/ml and 0.08 ng/ml. The measurement range was extended by more than 20 times for chemiluminescent ELISA. The chemiluminescent ELISA for anti-erythropoietin antibody detection showed a 1.9 to 2.6-fold increase in sensitivity for rabbit serum, and 1.8 to 8.9-fold for guinea pigs serum. Good correlation of results was found for quantitative detection of antibodies in rabbit sera using the two methods (R = 0.981). Thus, chemiluminescent ELISA allowed develop a more sensitive detection technique of IgG antibodies to human erythropoietin.

хемилюминесценциярекомбинантный эритропоэтинтвердофазный ИФАантитела к эритропоэтинулюминолиммуногенностьchemiluminescencerecombinant erythropoietinELISAantibodies to EPOluminolimmunogenicityReferencesHerrington W., Wieser C., Rosenkranz A.R. Pure red cell aplasia after treatment of renal anaemia with epoetin theta. Clin. Kidney J., 2013, Vol. 5, no. 6, pp. 539-542.Herrington W., Wieser C., Rosenkranz A.R. Pure red cell aplasia after treatment of renal anaemia with epoetin theta. Clin. Kidney J., 2013, Vol. 5, no. 6, pp. 539-542.Kamidate T., Maruya M., Tani H., Ishida A. Application of 4-iodophenol-enhanced luminolchemiluminescence to direct detection of horseradish peroxidase encapsulated in liposomes. Anal Sci., 2009, Vol. 9, no. 25, pp. 1163-1166.Kamidate T., Maruya M., Tani H., Ishida A. Application of 4-iodophenol-enhanced luminolchemiluminescence to direct detection of horseradish peroxidase encapsulated in liposomes. Anal Sci., 2009, Vol. 9, no. 25, pp. 1163-1166.Lonshakov D.V., Sheremet’ev S.V., Belosludtseva E.M., Korovkin S.A., Semchenko A.V., Katlinskij A.V. Synthesis of 4-aminobenzoic acid esters of polyethylene glycol and their use for pegylation of therapeutic proteins. RSC Adv. 2015, Vol. 5, no. 53, pp. 42903-42909.Lonshakov D.V., Sheremet’ev S.V., Belosludtseva E.M., Korovkin S.A., Semchenko A.V., Katlinskij A.V. Synthesis of 4-aminobenzoic acid esters of polyethylene glycol and their use for pegylation of therapeutic proteins. RSC Adv. 2015, Vol. 5, no. 53, pp. 42903-42909.Macdougall I.C., Roger S.D., de Francisco A., Goldsmith D.J., Schellekens H., Ebbers H., Jelkmann W., London G., Casadevall N., Hörl W.H., Kemeny D.M., Pollock C. Antibody-mediated pure red cell aplasia in chronic kidney disease patients receiving erythropoiesis stimulating agents: new insights. Kidney Int., 2012, Vol. 8, no. 81, pp. 727-732.Macdougall I.C., Roger S.D., de Francisco A., Goldsmith D.J., Schellekens H., Ebbers H., Jelkmann W., London G., Casadevall N., Hörl W.H., Kemeny D.M., Pollock C. Antibody-mediated pure red cell aplasia in chronic kidney disease patients receiving erythropoiesis stimulating agents: new insights. Kidney Int., 2012, Vol. 8, no. 81, pp. 727-732.Macdougall I.C., Casadevall N., Locatelli F., Combe C., London G.M., di Paolo S., Kribben A., Fliser D., Messner H., McNeil J., Stevens P., Santoro A., de Francisco A.L., Percheson P., Potamianou A., Foucher A., Fife D., Mérit V., Vercammen E. Incidence of erythropoietin antibody-mediated pure red cell aplasia: the Prospective Immunogenicity Surveillance Registry (PRIMS). Nephrol. Dial. Transplant., 2015, Vol. 3, no. 30, pp. 451-460.Macdougall I.C., Casadevall N., Locatelli F., Combe C., London G.M., di Paolo S., Kribben A., Fliser D., Messner H., McNeil J., Stevens P., Santoro A., de Francisco A.L., Percheson P., Potamianou A., Foucher A., Fife D., Mérit V., Vercammen E. Incidence of erythropoietin antibody-mediated pure red cell aplasia: the Prospective Immunogenicity Surveillance Registry (PRIMS). Nephrol. Dial. Transplant., 2015, Vol. 3, no. 30, pp. 451-460.Wang F., Driscoll D., Richardson D., Ambrogelly A.The comparison of chemiluminescent- and colorimetricdetection based ELISA for Chinese Hamster ovary host cell proteins quantification in biotherapeutics fengqiang. J. Bioproces. Biotechniq., 2013, Vol. 3, no. 3, pp. 1-7.Wang F., Driscoll D., Richardson D., Ambrogelly A.The comparison of chemiluminescent- and colorimetricdetection based ELISA for Chinese Hamster ovary host cell proteins quantification in biotherapeutics fengqiang. J. Bioproces. Biotechniq., 2013, Vol. 3, no. 3, pp. 1-7.Wang W., Lu Y., Zhang S., Wang S., Cao P., Tian Y., Zhang X. Development of a chemiluminescent imaging assay for the detection of anti-erythropoietin antibody in human sera. Luminescence, 2009, Vol. 1, no. 24, pp. 55-61.Wang W., Lu Y., Zhang S., Wang S., Cao P., Tian Y., Zhang X. Development of a chemiluminescent imaging assay for the detection of anti-erythropoietin antibody in human sera. Luminescence, 2009, Vol. 1, no. 24, pp. 55-61.Wayne O., Scalarone H., Scalarone G.M. Comparison of colorimetric and chemiluminescent ELISAs for the detection of antibodies to Blastomyces dermatitidis. J. Med. Biol. Sci., 2009, Vol. 3, no. 1, 2009, pp. 1-6.Wayne O., Scalarone H., Scalarone G.M. Comparison of colorimetric and chemiluminescent ELISAs for the detection of antibodies to Blastomyces dermatitidis. J. Med. Biol. Sci., 2009, Vol. 3, no. 1, 2009, pp. 1-6.Yang L., Jin M., Du P., Chen G., Zhang C., Wang J. Jin F., Shao H., She Y., Wang S., Zheng L., Wang J. Study on enhancement principle and stabilization for the luminol-H2O2-HRP chemiluminescence system. PLoS ONE, 2015, Vol. 10, no. 7, e0131193. doi: 10.1371/journal.pone.0131193.Yang L., Jin M., Du P., Chen G., Zhang C., Wang J. Jin F., Shao H., She Y., Wang S., Zheng L., Wang J. Study on enhancement principle and stabilization for the luminol-H2O2-HRP chemiluminescence system. PLoS ONE, 2015, Vol. 10, no. 7, e0131193. doi: 10.1371/journal.pone.0131193.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.