mimmunМедицинская иммунологияMedical Immunology (Russia)1563-06252313-741XSPb RAACI10.15789/1563-0625-2017-1-81-88mimmun-1168Research ArticleКРАТКИЕ СООБЩЕНИЯSHORT COMMUNICATIONSИНГИБИРОВАНИЕ ЭКСПРЕССИИ АКТИВИРУЮЩЕГО РЕЦЕПТОРА NKG2D НА NK-КЛЕТКАХ РЕКОМБИНАНТНЫМ БЕЛКОМ MICAINHIBITION OF THE NKG2D ACTIVATING RECEPTOR EXPRESSION ON CYTOTOXIC LYMPHOCYTES BY RECOMBINANT MICA PROTEINАбакушинаЕ. В.AbakushinaE. V.

к.м.н., старший научный сотрудник лаборатории клинической иммунологии, 

249036, Калужская область, г. Обнинск, ул. Королева, 4

PhD (Medicine), Senior Research Associate, Laboratory of Clinical Immunology, 

249036, Kaluga Region, Obninsk, Koroleva str., 4

abakushina@mail.ruЛысюкЕ. Ю.LyssukE. Yu.

к.б.н., старший научный сотрудник лаборатории генной терапии;

старший научный сотрудник лаборатории молекулярной иммунологии,

Москва

PhD (Biology), Senior Research Associate, Laboratory of Gene Therapy;

Senior Research Associate, Laboratory of Molecular Immunology,

Moscow

ПосвятенкоА. В.PosvyatenkoA. V.

к.б.н., научный сотрудник лаборатории генной терапии;

старший научный сотрудник лаборатории молекулярной иммунологии;

научный сотрудник лаборатории молекулярной онкологии Научно-исследовательского института трансляционной медицины,

Москва

PhD (Biology), Senior Research Associate, Laboratory of Gene Therapy;

Senior Research Associate, Laboratory of Molecular Immunology;

Research Associate, Laboratory of Molecular Oncology,

Moscow

КибардинА. В.KibardinA. V.

к.б.н., старший научный сотрудник лаборатории генной терапии;

старший научный сотрудник лаборатории молекулярной иммунологии,

Москва

PhD (Biology), Senior Research Associate, Laboratory of Gene Therapy;

Senior Research Associate, Laboratory of Molecular Immunology,

Moscow

Медицинский радиологический научный центр им. А.Ф. Цыба – филиал ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский радиологический центр» Министерства здравоохранения РФРоссияTsyb Medical Radiological Research Centre – Branch of the National Medical Research Radiological CentreRussian FederationФГБУН «Институт биологии гена» РАН; ФГБУ «Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии имени Дмитрия Рогачева» Министерства здравоохранения РФРоссияInstitute of Gene Biology, Russian Academy of Sciences; Dmitry Rogachev Federal Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and ImmunologyRussian FederationФГБУН «Институт биологии гена» РАН; ФГБУ «Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии имени Дмитрия Рогачева» Министерства здравоохранения РФ; ФГБОУ ВО «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения РФРоссияInstitute of Gene Biology, Russian Academy of Sciences; Dmitry Rogachev Federal Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology; N. Pirogov Russian National Research Medical UniversityRussian Federation2017230120171918188Copyright © Абакушина Е.В., Лысюк Е.Ю., Посвятенко А.В., Кибардин А.В., 20172017Абакушина Е.В., Лысюк Е.Ю., Посвятенко А.В., Кибардин А.В.Abakushina E.V., Lyssuk E.Y., Posvyatenko A.V., Kibardin A.V.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.mimmun.ru/mimmun/article/view/1168

Нестабильность генома трансформированных клеток как одна из основных причин опухолевого роста может приводить к появлению в клетке ряда атипичных белков. Такие белки могут распознаваться иммунной системой и приводить к уничтожению измененных клеток. С другой стороны, фенотипическая нестабильность может влиять на появление трансформированных клеток, напрямую подавляющих эффекторное звено иммунного ответа и/или не распознаваемых цитотоксическими лимфоцитами. Одним из наиболее важных активирующих рецепторов, экспрессируемых NK-клетками, является рецептор NKG2D, необходимый для обнаружения и уничтожения трансформированных и инфицированных клеток. Лигандами для NKG2D являются поверхностные или свободно циркулирующие стресс-индуцируемые неканонические молекулы главного комплекса гистосовместимости I класса MICA/B (MHC class I chain–related proteins A and B). MICA и MICB отсутствуют или слабо экспрессируются в большинстве нормальных клеток. В то же время в опухолевых и инфицированных вирусами клетках их количество существенно повышено. Взаимодействие NKG2D со своими лигандами играет важную роль в регуляции противоопухолевых иммунных реакций. Так, накопление в крови растворимой формы MICA за счет протеолитического шеддинга с поверхности опухолевых клеток может блокировать NKG2D-опосредованную противоопухолевую цитотоксичность и, таким образом, способствовать ускользанию опухолевых клеток от иммунного надзора.

Цель настоящего исследования заключалась в оценке блокирующего эффекта растворимого рекомбинантного белка MICA человека (rhsMICA) на рецептор NK-клеток NKG2D. Для этого выделенные из периферической крови мононуклеарные клетки обрабатывали различными концентрациями (0, 1, 5 и 10 мкг/мл) растворимого рекомбинантного белка человека MICA, после чего клетки окрашивали антителами против CD314 (NKG2D) и проводили цитометрический анализ CD3- CD56+NK- клеток. Кроме того, аналогично анализировали активированные IL-2 и IL-15 лимфоциты больного меланомой. Показано, что кратковременная обработка лимфоцитов rhsMICA значительно снижает экспрессию рецептора NKG2D на цитотоксических лимфоцитах как у здоровых доноров, так и у больных меланомой, при этом изменения зависят от дозы rhsMICA. В то же время после активации цитокинами лимфоциты становятся, по всей видимости, более устойчивыми к ингибирующему воз- действию rhsMICA, в результате чего значимого снижения экспрессии NKG2D на активированных NK-клетках не происходит. Данный факт дает предпосылки к использованию активированных NK- клеток для адоптивной иммунотерапии онкологических больных с MICA-позитивными опухолями.

Genome instability of transformed cells, being the most common factor of malignancy, may result into production of abnormal proteins in these cells. Normally, the newly formed proteins are recognized by immune system, thus causing elimination of the transformed cells. Nevertheless, the phenotypic instability promotes formation of specific transformed cells which suppress effector immune reactions and/or are unrecognizable by cytotoxic lymphocytes. NKG2D is one of the most important activating receptors expressed by NK cells. It serves as a major recognition receptor for detection and elimination of tumor and infected cells. The ligands for NKG2D include surface or circulating non-canonical MICA/B molecules from class I major histocompatibility complex (MHC class I chain–related proteins A and B). MICA and MICB are expressed scarcely, if at all, by the most normal cells, being, however, upregulated in cancer cells and virus-infected cells.

NKG2D receptor-ligand interaction is important for regulation of anti-tumor immune reactions. The soluble form of MICA accumulated in blood due to proteolytic shedding from tumor cell membranes is able to inhibit the NKG2D mediated anti-tumor cytotoxicyty and, therefore, promote the immune escape. The aim of our study was to estimate blocking effects of soluble recombinant human MICA protein (rhsMICA) upon NKG2D receptor of NK cells.

Mononuclear cells were isolated from peripheral blood, followed by incubation with of rhsMICA at different concentrations (0, 1, 5, or 10 µg/ml), staining with anti-CD314 (NKG2D) mAbs on the CD3- CD56+NK cells, and flow cytometry analysis. A similar treatment protocol was applied for IL2- and IL15-activated mononuclear cells isolated from the melanoma patients.

It has been shown that brief incubation of lymphocytes with rhsMICA caused a significantly reduced expression of NKG2D receptor on the surface of cytotoxic lymphocytes, both from healthy donors and melanoma patients. These changes depended on the MICA dose. Meanwhile, the cytokine-activated lymphocytes seem to become more resistant to inhibiting effects of rhsMICA, and, thus, do not cause any significant reduction of NKG2D expression on the activated NK cells. This fact may be a pre-requisite for usage of activated NK-cells for adoptive immunotherapy of cancer patients with MICA-positive malignancies.

NK-клеткиактивирующий рецептор NKG2DNKG2D лигандыстресс-индуцированные молекулы MICAингибирование NKG2DNK cellsNKG2D activating receptorNKG2D ligandsstress-induced MICANKG2D inhibitionгрант Российского научного фонда, грант ПрезидентаReferencesАбакушина Е.В., Абакушин Д.Н., Неприна Г.С., Пасова И.А., Бердов Б.А., Клинкова А.В., Коваленко Е.И., Каприн А.Д. Повышение уровня цитокинов и стресс-индуцированных молекул MICA в сыворотке крови больных раком желудка и толстой кишки // Цитокины и воспаление, 2015. Т. 14, № 1. С. 63-67. [Abakushina E.V., Abakushin D.N., Neprina G.S., Pasova I.A., Berdov B.A., Klinkova A.V., Kovalenko E.I., Kaprin A.D. Elevation of serum levels of cytokines and stress-induced molecules MICA in patients with gaster and colon cancer. Tsitokiny i vospalenie = Cytokines and Inflammation, 2015, Vol. 14, no. 1. pp. 63-67. (In Russ.)]Абакушина Е.В., Абакушин Д.Н., Неприна Г.С., Пасова И.А., Бердов Б.А., Клинкова А.В., Коваленко Е.И., Каприн А.Д. Повышение уровня цитокинов и стресс-индуцированных молекул MICA в сыворотке крови больных раком желудка и толстой кишки // Цитокины и воспаление, 2015. Т. 14, № 1. С. 63-67. [Abakushina E.V., Abakushin D.N., Neprina G.S., Pasova I.A., Berdov B.A., Klinkova A.V., Kovalenko E.I., Kaprin A.D. Elevation of serum levels of cytokines and stress-induced molecules MICA in patients with gaster and colon cancer. Tsitokiny i vospalenie = Cytokines and Inflammation, 2015, Vol. 14, no. 1. pp. 63-67. (In Russ.)]Абакушина Е.В., Маризина Ю.В., Каприн А.Д. Морфо-функциональная характеристика лимфоцитов человека после активации in vitro // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2016. Т. 161, № 5. C. 678-683. [Abakushina E.V., Marizina Yu.V., Kaprin A.D. The morpho-functional characteristic of human lymphocytes after activation in vitro. Byulleten` eksperimental`noy biologii i meditsiny = Bulletin of Experimental Biology and Medicine, 2016, no. 5, pp. 678-683. (In Russ.)]Абакушина Е.В., Маризина Ю.В., Каприн А.Д. Морфо-функциональная характеристика лимфоцитов человека после активации in vitro // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2016. Т. 161, № 5. C. 678-683. [Abakushina E.V., Marizina Yu.V., Kaprin A.D. The morpho-functional characteristic of human lymphocytes after activation in vitro. Byulleten` eksperimental`noy biologii i meditsiny = Bulletin of Experimental Biology and Medicine, 2016, no. 5, pp. 678-683. (In Russ.)]Абакушина Е.В., Маризина Ю.В., Неприна Г.С. Эффективность совместного применения IL-2 и IL-15 для активации цитотоксических лимфоцитов in vitro // Гены и клетки, 2015. Т. 10, № 2. C. 78-85. [Abakushina E.V., Marizina Yu.V., Neprina G.S. Efficiency of IL-2 and IL-15 combined use for activation of cytotoxic lymphocytes in vitro. Geny i kletki = Gene and Cells, 2015, Vol. 10, no. 2, рp. 78-85. (In Russ.)]Абакушина Е.В., Маризина Ю.В., Неприна Г.С. Эффективность совместного применения IL-2 и IL-15 для активации цитотоксических лимфоцитов in vitro // Гены и клетки, 2015. Т. 10, № 2. C. 78-85. [Abakushina E.V., Marizina Yu.V., Neprina G.S. Efficiency of IL-2 and IL-15 combined use for activation of cytotoxic lymphocytes in vitro. Geny i kletki = Gene and Cells, 2015, Vol. 10, no. 2, рp. 78-85. (In Russ.)]Абакушина Е.В., Маризина Ю.В., Неприна Г.С., Кудрявцев Д.В, Кудрявцева Г.Т., Селиванова Н.В. Фенотип лимфоцитов у больных меланомой кожи после иммунотерапии активированными лимфоцитами // Медицинская иммунология, 2014. Т. 16, № 6. C. 567-576. [Abakushina E.V., Marizina Yu.V., Neprina G.S., Kudryavtsev D.V., Kudryavtseva G.T., Selivanova N.V. Lymphocyte phenotype in patients with skin melanoma after immunotherapy of activated lymphocytes. Meditsinskaya immunologiya = Medical Immunology (Russia), 2014, Vol. 16, no. 6, pp. 567-576. (In Russ.)] DOI: http://dx.doi.org/10.15789/1563-0625-2014-6-567-576Абакушина Е.В., Маризина Ю.В., Неприна Г.С., Кудрявцев Д.В, Кудрявцева Г.Т., Селиванова Н.В. Фенотип лимфоцитов у больных меланомой кожи после иммунотерапии активированными лимфоцитами // Медицинская иммунология, 2014. Т. 16, № 6. C. 567-576. [Abakushina E.V., Marizina Yu.V., Neprina G.S., Kudryavtsev D.V., Kudryavtseva G.T., Selivanova N.V. Lymphocyte phenotype in patients with skin melanoma after immunotherapy of activated lymphocytes. Meditsinskaya immunologiya = Medical Immunology (Russia), 2014, Vol. 16, no. 6, pp. 567-576. (In Russ.)] DOI: http://dx.doi.org/10.15789/1563-0625-2014-6-567-576Бережной А.Е., Гнучев Н.В., Георгиев Г.П., Козлов А.М., Ларин С.С. Молекулярные механизмы взаимодействия опухоли и иммунной системы // Вопросы онкологии, 2008. Т. 54, № 6. C. 669-683. [Berezhnoy A.E., Gnouchev N.V., Georgiev G.P., Kozlov A.M., Larin S.S. Molecular mechanisms of interaction between the tumor and the immune system. Voprosy onkologii = Problems in Oncology, 2008, Vol. 54, no. 6, pp. 669-683. (In Russ.)]Бережной А.Е., Гнучев Н.В., Георгиев Г.П., Козлов А.М., Ларин С.С. Молекулярные механизмы взаимодействия опухоли и иммунной системы // Вопросы онкологии, 2008. Т. 54, № 6. C. 669-683. [Berezhnoy A.E., Gnouchev N.V., Georgiev G.P., Kozlov A.M., Larin S.S. Molecular mechanisms of interaction between the tumor and the immune system. Voprosy onkologii = Problems in Oncology, 2008, Vol. 54, no. 6, pp. 669-683. (In Russ.)]Бережной А.Е., Чернышева А.Д., Закеева И.Р., Данилова А.Б., Данилов А.О., Моисеенко В.М., Geraghty D., Гнучев Н.В., Георгиев Г.П., Кибардин А.В., Ларин С.С. Индукция экспрессии молекулы HLA-E на поверхности опухолевых клеток интерфероном-гамма приводит к защите опухолевых клеток от цитотоксического действия лимфоцитов // Вопросы онкологии, 2009. Т. 55, № 2. С. 224-229. [Berezhnoy A.E., Chernysheva A.D., Zakeeva I.R., Danilova A.B., Danilov A.O., Moiseyenko V.M., Geraghty D., Gnouchev N.V., Georgiyev G.P., Kibardin A.V., Larin S.S. HLA-E molecule induction on the surface of tumor cells protects them from cytotoxic lymphocytes. Voprosy onkologii = Problems in Oncology, 2009, Vol. 55, no. 2, pp. 224-229. (In Russ.)]Бережной А.Е., Чернышева А.Д., Закеева И.Р., Данилова А.Б., Данилов А.О., Моисеенко В.М., Geraghty D., Гнучев Н.В., Георгиев Г.П., Кибардин А.В., Ларин С.С. Индукция экспрессии молекулы HLA-E на поверхности опухолевых клеток интерфероном-гамма приводит к защите опухолевых клеток от цитотоксического действия лимфоцитов // Вопросы онкологии, 2009. Т. 55, № 2. С. 224-229. [Berezhnoy A.E., Chernysheva A.D., Zakeeva I.R., Danilova A.B., Danilov A.O., Moiseyenko V.M., Geraghty D., Gnouchev N.V., Georgiyev G.P., Kibardin A.V., Larin S.S. HLA-E molecule induction on the surface of tumor cells protects them from cytotoxic lymphocytes. Voprosy onkologii = Problems in Oncology, 2009, Vol. 55, no. 2, pp. 224-229. (In Russ.)]Закеева И.Р., Бережной А.Е., Гнучев Н.В., Георгиев Г.П., Ларин С.С. Ингибиторные рецепторы лимфоцитов и их роль а противоопухолевом иммунитете // Вопросы онкологии, 2007. Т. 53, № 2. С. 140-149. [Zakeeva I.R., Berezhnoy A.E., Gnuchev N.V., Georgiyev G.P., Larin S.S. Inhibitory receptors of lymphocytes and their role in antitumor immunity. Voprosy onkologii = Problems in Oncology, 2007, Vol. 53, no. 2, pp. 140-149. (In Russ.)]Закеева И.Р., Бережной А.Е., Гнучев Н.В., Георгиев Г.П., Ларин С.С. Ингибиторные рецепторы лимфоцитов и их роль а противоопухолевом иммунитете // Вопросы онкологии, 2007. Т. 53, № 2. С. 140-149. [Zakeeva I.R., Berezhnoy A.E., Gnuchev N.V., Georgiyev G.P., Larin S.S. Inhibitory receptors of lymphocytes and their role in antitumor immunity. Voprosy onkologii = Problems in Oncology, 2007, Vol. 53, no. 2, pp. 140-149. (In Russ.)]Bae D.S., Hwang Y.K., Lee J.K. Importance of NKG2D NKG2D ligands interaction for cytolytic activity of natural killer cell. Cellular Immunology, 2012, Vol. 276, pp. 122-127.Bae D.S., Hwang Y.K., Lee J.K. Importance of NKG2D NKG2D ligands interaction for cytolytic activity of natural killer cell. Cellular Immunology, 2012, Vol. 276, pp. 122-127.Doubrovina E.S., Doubrovin M.M., Vider E., Sisson R.B., O’Reilly R.J., Dupont B., Vyas Y.M. Evasion from NK cell immunity by MHC class I chain-related molecules expressing colon adenocarcinoma. J. Immunol., 2003, Vol. 171, no. 12, pp. 6891-6899.Doubrovina E.S., Doubrovin M.M., Vider E., Sisson R.B., O’Reilly R.J., Dupont B., Vyas Y.M. Evasion from NK cell immunity by MHC class I chain-related molecules expressing colon adenocarcinoma. J. Immunol., 2003, Vol. 171, no. 12, pp. 6891-6899.El-Gazzar A., Groh V., Spies T. Immunobiology and conflicting roles of the human NKG2D lymphocyte receptor and its ligands in cancer. Immunology, 2013, Vol. 191, pp. 1509-1515.El-Gazzar A., Groh V., Spies T. Immunobiology and conflicting roles of the human NKG2D lymphocyte receptor and its ligands in cancer. Immunology, 2013, Vol. 191, pp. 1509-1515.Fernandez L., Portugal R., Valentin J., Martín R., Maxwell H., González-Vicent M., Ángel Díaz M., de Prada I., Pérez-Martínez A. In vitro natural killer cell immunotherapy for medulloblastoma. Frontiers in Oncology, 2013, Vol. 3, Art. 94.Fernandez L., Portugal R., Valentin J., Martín R., Maxwell H., González-Vicent M., Ángel Díaz M., de Prada I., Pérez-Martínez A. In vitro natural killer cell immunotherapy for medulloblastoma. Frontiers in Oncology, 2013, Vol. 3, Art. 94.Groh V., Wu J., Yee C., Spies T. Tumour-derived soluble MIC ligands impair expression of NKG2D and T-cell activation. Nature, 2002, Vol. 419, pp. 734-738.Groh V., Wu J., Yee C., Spies T. Tumour-derived soluble MIC ligands impair expression of NKG2D and T-cell activation. Nature, 2002, Vol. 419, pp. 734-738.Krieg S., Ullrich E. Novel immune modulators used in hematology: impact on NK cells. Front. Immunol., 2013, Vol. 3, Art. 388.Krieg S., Ullrich E. Novel immune modulators used in hematology: impact on NK cells. Front. Immunol., 2013, Vol. 3, Art. 388.Martin G.S. Cell signaling and cancer. Cancer Cell., 2003, Vol. 4, pp. 167-174.Martin G.S. Cell signaling and cancer. Cancer Cell., 2003, Vol. 4, pp. 167-174.Pardoll D. Immunology. Stress, NK Receptors, and Immune Surveillance. Science, 2001, Vol. 294, pp. 534-538.Pardoll D. Immunology. Stress, NK Receptors, and Immune Surveillance. Science, 2001, Vol. 294, pp. 534-538.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.