mimmunМедицинская иммунологияMedical Immunology (Russia)1563-06252313-741XSPb RAACI10.15789/1563-0625-2016-6-575-582mimmun-1140Research ArticleКРАТКИЕ СООБЩЕНИЯSHORT COMMUNICATIONSИНТЕРНАЛИЗАЦИЯ АНТИМИКРОБНОГО ПЕПТИДА АЦИПЕНСИНА 1 В ОПУХОЛЕВЫЕ КЛЕТКИ ЧЕЛОВЕКАINTERNALIZATION OF ANTIMICROBIAL PEPTIDE ACIPENSIN 1 INTO HUMAN TUMOR CELLSУмняковаЕ. С.UmnyakovaE. S.

аспирант, научный сотрудник

PhD Student, Research Associate

umka-biolog@mail.ruКудрявцевИ. В.KudryavtsevI. V.

к.б.н., старший научный сотрудник

PhD (Biology), Senior Research Associate

umka-biolog@mail.ruГрудининаН. А.GrudininaN. A.

к.б.н., старший научный сотрудник

PhD (Biology), Senior Research Associate

umka-biolog@mail.ruБаландинС. В.BalandinS. V.

к.х.н., научный сотрудник Учебно-научного центра

umka-biolog@mail.ruБолосовИ. А.BolosovI. A.

младший научный сотрудник Учебно-научного центра

Junior Research Associate

umka-biolog@mail.ruПантелеевП. В.PanteleevP. V.

к.х.н., младший научный сотрудник Учебно-научного центра

PhD (Chemistry), Junior Research Associate

umka-biolog@mail.ruФилатенковаТ. А.FilatenkovaT. A.

аспирант, младший научный сотрудник

PhD Student, Junior Research Associate

umka-biolog@mail.ruОрловД. С.OrlovD. S.

к.м.н., доцент, старший научный сотрудник

PhD (Medicine), Associate Professor, Senior Research Associate

umka-biolog@mail.ruЦветковаЕ. В.TsvetkovaE. V.

к.б.н., старший научный сотрудник

PhD (Biology), Senior Research Associate

umka-biolog@mail.ruОвчинниковаТ. В.OvchinnikovaT. V.

д.х.н., доцент, заведующая отделом «Учебно-научный центр»

PhD, MD (Chemistry), Associate Professor, Head, Research Educational Centre

umka-biolog@mail.ruКокряковВ. Н.KokryakovV. N.

д.б.н., профессор, заведующий лабораторией отдела общей патологии и патофизиологии

PhD, MD (Biology), Professor, Head of Laboratory, Department of General Pathology and Pathological Physiology; Professor

umka-biolog@mail.ruШамоваО. В.ShamovaO. V.

д.б.н., доцент, заведующая отделом общей патологии и патофизиологии

PhD, MD (Biology), Associate Professor, Head, Department of General Pathology and Pathological Physiology

umka-biolog@mail.ruФГБНУ «Институт экспериментальной медицины», Санкт-Петербург, РоссияInstitute of Experimental Medicine, St. Petersburg, Russian FederationФГБНУ «Институт экспериментальной медицины», Санкт-Петербург, Россия ГБОУ ВПО «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова» Министерства здравоохранения РФ, Санкт-Петербург, РоссияInstitute of Experimental Medicine, St. Petersburg, Russian Federation The First St. Petersburg I. Pavlov State Medical University, St. Petersburg, Russian FederationФГБУН «Институт биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова» РАН, Москва, РоссияM.M. Shemyakin and Yu.A. Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences, Moscow, Russian FederationФГБНУ «Институт экспериментальной медицины», Санкт-Петербург, Россия Санкт-Петербургский государственный университет, Санкт-Петербург, РоссияInstitute of Experimental Medicine, St. Petersburg, Russian FederationФГБНУ «Институт экспериментальной медицины», Санкт-Петербург, Россия Санкт-Петербургский государственный университет, Санкт-Петербург, РоссияInstitute of Experimental Medicine, St. Petersburg, Russian Federation St. Petersburg State University, St. Petersburg, Russian Federation201608122016186575582Copyright © Умнякова Е.С., Кудрявцев И.В., Грудинина Н.А., Баландин С.В., Болосов И.А., Пантелеев П.В., Филатенкова Т.А., Орлов Д.С., Цветкова Е.В., Овчинникова Т.В., Кокряков В.Н., Шамова О.В., 20162016Умнякова Е.С., Кудрявцев И.В., Грудинина Н.А., Баландин С.В., Болосов И.А., Пантелеев П.В., Филатенкова Т.А., Орлов Д.С., Цветкова Е.В., Овчинникова Т.В., Кокряков В.Н., Шамова О.В.Umnyakova E.S., Kudryavtsev I.V., Grudinina N.A., Balandin S.V., Bolosov I.A., Panteleev P.V., Filatenkova T.A., Orlov D.S., Tsvetkova E.V., Ovchinnikova T.V., Kokryakov V.N., Shamova O.V.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.mimmun.ru/mimmun/article/view/1140

Поиск новых соединений, обеспечивающих доставку лекарственных препаратов в инфицированные или опухолевые клетки, является актуальной задачей биомедицинских исследований. К числу таких соединений относятся проникающие в клетки пептиды (Cell-Penetrating Peptides), которые легко транслоцируются через мембраны эукариотических клеток и могут служить переносчиками разнообразных терапевтических агентов в клетки. Целью данной работы явилось изучение способности антимикробного пептида системы врожденного иммунитета – аципенсина 1 – проникать в опухолевые клетки человека in vitro. Аципенсин 1 – катионный пептид, выделенный нами ранее из лейкоцитов русского осетра Acipenser gueldenstaedtii. В рамках данного исследования впервые установлено, что аципенсин 1 может проникать в эукариотические клетки без их повреждения. Разработана процедура получения рекомбинантного препарата аципенсина 1, проведена конъюгация пептида с флуоресцентным маркером BODIPY FL. С использованием конфокальной микроскопии показано, что меченый аципенсин 1 быстро транслоцируется в клетки эритромиелоидного лейкоза человека линии К-562 и детектируется во внутриклеточном пространстве уже чрез 5 мин после добавления его в культуру клеток. С помощью проточной цитометрии изучена кинетика проникновения меченых пептидов (в нетоксических микромолярных концентрациях) в клетки К-562, получены данные о быстрой интернализации меченого пептида в исследуемые клетки, подтверждающие результаты микроскопического анализа: несущий флуоресцентную метку пептид выявлялся в клетках К-562 через 2-3 секунды после внесения препарата инкубационную среду, максимум флуоресценции достигался на сроке около 45 секунд, с дальнейшим выходом «на плато» на сроках свыше 100 секунд после стимуляции клеток исследуемым соединением. Установленные факты подтверждают концепцию о том, что антимикробные пептиды врожденного иммунитета обладают свойствами проникающих в клетки пептидов, а также позволяют рассматривать исследуемый антимикробный пептид аципенсин 1 как перспективное соединение, на основе которого могут быть разработаны новые лекарственные препараты с повышенной способностью проникать в клетки-мишени, участвующие в патологических процессах и, следовательно, с более высокой эффективностью терапевтического действия.

Search for new compounds providing delivery of drugs into infected or neoplastic cells, is an important direction of biomedical research. Cell-penetrating peptides are among those compounds, due to their ability to translocate through membranes of eukaryotic cells, serving as potential carriers of various therapeutic agents to the target cells. The aim of present work was to investigate the ability of acipensin 1, an antimicrobial peptide of innate immune system, for in vitro penetration into human tumor cells. Acipensin 1 is a cationic peptide that we have previously isolated from leukocytes of the Russian sturgeon, Acipenser gueldenstaedtii. Capability of acipensin 1 to enter the human erytroleukemia K-562 cells has been investigated for the first time. A biotechnological procedure for producing a recombinant acipensin 1 peptide has been developed. The obtained peptide was conjugated with a fluorescent probe BODIPY FL. By means of confocal microscopy, we have shown that the tagged acipensin 1 rapidly enters into K-562 cells and can be detected in the intracellular space within 5 min after its addition to the cell culture. Using flow cytometry technique, penetration kinetics of the labeled peptide into K-562 cells (at nontoxic micromolar concentrations) has been studied. We have observed a rapid internalization of the peptide to the target cells, thus confirming the results of microscopic analysis, i.e, the labeled acipensin was detectable in K-562 cells as soon as wihin 2-3 seconds after its addition to the incubation medium. The maximum of fluorescence was reached within a period of approx. 45 seconds, with further “plateau” at the terms of >100 seconds following cell stimulation with the test compound. These data support the concept, that the antimicrobial peptides of innate immunity system possess the features of cell-penetrating peptides, and allow us to consider the studied sturgeon peptide a promising template for development of new drugs with increased ability to enter the cells implicated into pathological processes, and, therefore, higher therapeutic efficiency.

проникающие в клетки пептидыантимикробные пептидыаципенсин 1cell-penetrating peptidesantimicrobial peptidesacipensin 1ReferencesШамова О.В., Сакута Г.А., Орлов Д.С., Зенин В.В., Штейн Г.И., Колодкин Н.И., Афонина И.Н., Кокряков В.Н. Действие антимикробных пептидов из нейтрофильных гранулоцитов на опухолевые и нормальные клетки в культуре // Цитология, 2007. Т. 49, № 12. С. 1000-1010. [Shamova O.V., Sakuta G.A., Orlov D.S., Zenin V.V., Shtein G.I., Kolodkin N.I., Afonina I.V., Kokriakov V.N. Effects of antimicrobial peptides of neutrophils on tumor and normal cells in culture. Tsitologiya = Cytology, 2007, Vol. 49, no. 12, pp. 1000-1010. (In Russ.)]Шамова О.В., Сакута Г.А., Орлов Д.С., Зенин В.В., Штейн Г.И., Колодкин Н.И., Афонина И.Н., Кокряков В.Н. Действие антимикробных пептидов из нейтрофильных гранулоцитов на опухолевые и нормальные клетки в культуре // Цитология, 2007. Т. 49, № 12. С. 1000-1010. [Shamova O.V., Sakuta G.A., Orlov D.S., Zenin V.V., Shtein G.I., Kolodkin N.I., Afonina I.V., Kokriakov V.N. Effects of antimicrobial peptides of neutrophils on tumor and normal cells in culture. Tsitologiya = Cytology, 2007, Vol. 49, no. 12, pp. 1000-1010. (In Russ.)]Chugh A., Eudes F., Shim Y.S. Cell-penetrating peptides: nanocarrier for macromolecule delivery in living cells. IUBMB Life, 2010, Vol. 62, no. 3, pp. 183-193.Chugh A., Eudes F., Shim Y.S. Cell-penetrating peptides: nanocarrier for macromolecule delivery in living cells. IUBMB Life, 2010, Vol. 62, no. 3, pp. 183-193.Dinca A., Chien W.M., Chin M.T. Intracellular Delivery of proteins with cell-penetrating peptides for therapeutic uses in human disease. Int. J. Mol. Sci., 2016, Vol. 17, no. 2, p. 263.Dinca A., Chien W.M., Chin M.T. Intracellular Delivery of proteins with cell-penetrating peptides for therapeutic uses in human disease. Int. J. Mol. Sci., 2016, Vol. 17, no. 2, p. 263.Johnson R.M., Harrison S.D., Maclean D. Therapeutic applications of cell-penetrating peptides. Methods in Molecular Biology, 2011, Vol. 683, pp. 535-551.Johnson R.M., Harrison S.D., Maclean D. Therapeutic applications of cell-penetrating peptides. Methods in Molecular Biology, 2011, Vol. 683, pp. 535-551.Park C., Yi K., Matsuzaki K., Kim M., Kim S. Structure-activity analysis of buforin II, a histone H2A-derived antimicrobial peptide: the proline hinge is responsible for the cell-penetrating ability of buforin II. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, Vol. 97, pp. 8245-8250.Park C., Yi K., Matsuzaki K., Kim M., Kim S. Structure-activity analysis of buforin II, a histone H2A-derived antimicrobial peptide: the proline hinge is responsible for the cell-penetrating ability of buforin II. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, Vol. 97, pp. 8245-8250.Reissmann S. Cell penetration: scope and limitations by the application of cell-penetrating peptides. J. Pept Sci., 2014, Vol. 20, no. 10, pp. 760-784.Reissmann S. Cell penetration: scope and limitations by the application of cell-penetrating peptides. J. Pept Sci., 2014, Vol. 20, no. 10, pp. 760-784.Shamova O.V., Orlov D.S., Balandin S.V., Shramova E.I., Tsvetkova E.V., Panteleev P.V., Leonova Yu.F., Tagaev A.A., Kokryakov V.N. Ovchinnikova Acipensins – novel antimicrobial peptides from leukocytes of the Russian sturgeon Acipenser gueldenstaedtii. Acta Naturae, 2014, Vol. 6, no. 4, pp. 99-109.Shamova O.V., Orlov D.S., Balandin S.V., Shramova E.I., Tsvetkova E.V., Panteleev P.V., Leonova Yu.F., Tagaev A.A., Kokryakov V.N. Ovchinnikova Acipensins – novel antimicrobial peptides from leukocytes of the Russian sturgeon Acipenser gueldenstaedtii. Acta Naturae, 2014, Vol. 6, no. 4, pp. 99-109.Soomets U., Lindgren M., Gallet X., Hällbrink M., Elmquist A., Balaspiri L., Zorko M., Pooga M., Brasseur R., Langel U. Deletion analogues of transportan. Biochim. Biophys. Acta, 2000, Vol. 1467, no. 1, pp. 165-176.Soomets U., Lindgren M., Gallet X., Hällbrink M., Elmquist A., Balaspiri L., Zorko M., Pooga M., Brasseur R., Langel U. Deletion analogues of transportan. Biochim. Biophys. Acta, 2000, Vol. 1467, no. 1, pp. 165-176.Sparr C., Purkayastha N., Kolesinska B., Gengenbacher M., Amulic B., Matuschewski K., Seebach D., Kamena F. Improved efficacy of fosmidomycin against Plasmodium and Mycobacterium species by combination with the cell-penetrating peptide octaarginine. Antimicrob Agents Chemother., 2013, Vol. 57, no. 10, pp. 4689-4698.Sparr C., Purkayastha N., Kolesinska B., Gengenbacher M., Amulic B., Matuschewski K., Seebach D., Kamena F. Improved efficacy of fosmidomycin against Plasmodium and Mycobacterium species by combination with the cell-penetrating peptide octaarginine. Antimicrob Agents Chemother., 2013, Vol. 57, no. 10, pp. 4689-4698.Splith K., Neundorf I. Antimicrobial peptides with cell-penetrating peptide properties and vice versa. Eur. Biophys. J., 2011, Vol. 40, pp. 387-397.Splith K., Neundorf I. Antimicrobial peptides with cell-penetrating peptide properties and vice versa. Eur. Biophys. J., 2011, Vol. 40, pp. 387-397.Tomasinsig L., Skerlavaj B., Papo N., Giabbai B., Shai Y., Zanetti M. Mechanistic and functional studies of the interaction of a proline-rich antimicrobial peptide with mammalian cells. J. Biol. Chem., 2006, Vol. 281, pp. 383-391.Tomasinsig L., Skerlavaj B., Papo N., Giabbai B., Shai Y., Zanetti M. Mechanistic and functional studies of the interaction of a proline-rich antimicrobial peptide with mammalian cells. J. Biol. Chem., 2006, Vol. 281, pp. 383-391.van Amersfoort E.S., van Strijp J.A. Evaluation of a flow cytometric fluorescence-quenching assay of phagocytosis of sensitized sheep erythrocytes by polymorphonuclear leukocytes. Cytometry, 1994, Vol. 17, no. 4, pp. 294-301.van Amersfoort E.S., van Strijp J.A. Evaluation of a flow cytometric fluorescence-quenching assay of phagocytosis of sensitized sheep erythrocytes by polymorphonuclear leukocytes. Cytometry, 1994, Vol. 17, no. 4, pp. 294-301.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.